1. Inleiding 3 1Waarom is de leerstof in deze module zinvol? 3



Dovnload 103.87 Kb.
Datum21.08.2016
Grootte103.87 Kb.



Inhoudsopgave Telmethoden

Bepaling aantal micro-organismen



1.Inleiding 3

1Waarom is de leerstof in deze module zinvol? 3

2Onderscheid totaaltellingen en levendtellingen 5

2..Methoden totaaltellingen 5

3Microscopische tellingen. 5

3.1.1.De telling volgens Breed. 5

3.1.2.Telling met behulp van een telkamertje 7

4Indirecte totaaltellingen 8

4.1.1.Coulter Counter 8

4.1.2.De meting van de troebeling van een suspensie (turbidimetrie) 9

4.1.3.Andere indirecte bepalingen om het aantal cellen vast te stellen 11

3. Methoden levendtellingen 13

5 Voorbereidingen voor het onderzoek 13

A Het homogeniseren 13

B. Het aanleggen van een verdunningsreeks 14

6Tellingen m.b.v. een vaste voedingsbodem 15

6.1.1.Mengplaatmethode en strijkplaatmethode 15

6.1.2.De beoordeling van de platen 16

Welke platen worden geteld? 16

De factor tien 16

6.1.3.De berekening van het kiemgetal 16

6.1.4.Kolonievormende eenheden ( k.v.e's) 17

6.1.5.Het noteren van het kiemgetal 17

6.1.6.Welke verdunningen worden er ingezet? 17

6.1.7.Stempel en swab methode voor het onderzoek van oppervlakken. 18

6.1.8.Membraanfiltratie 18

6.1.9.Selectieve kiemgetalbepalingen. 18

7Telling met behulp van vloeibare media 19

8Presence/Absencetesten 23

9Indirecte bepaling van het aan­tal le­vende micro-organis­men 24

9.1.1.De ATP-bepaling 24

9.1.2.De bactometer 24

Leerdoelen Telmethoden 26

9.1.3.Oefenopgaven 27



  1. Inleiding

De informatie over de bepaling van het aantal micro-organisme staat in dit moduleboekje, in Microbiologie Technieken en in Microbiologie Proeven staan proeven beschreven waarin aantal micro-organismen wordt bepaald. Bij deze moduletekst zijn oefeningen.

In veel gevallen staan de antwoorden letterlijk in de tekst. In andere gevallen worden er rekenopgaven gegeven. Last but not least! wordt je in enkele oefeningen gevraagd om de methoden met elkaar te vergelijken, en hun toepassingen te bespreken. Leg ook verbanden met het praktikum ! en kijk dan ook in de practicumboeken, Microbiologie Technieken en Microbiologie Proeven.

1Waarom is de leerstof in deze module zinvol?

Bij het microbiologisch onderzoek naar de aanwezigheid van micro-organismen zijn er twee mogelijkheden:



  • Men wil de aanwezigheid van een micro-organisme in een bepaald monster vaststellen. Dit omdat de aanwezigheid een gevaar voor de consument kan zijn (onderzoek levens­middelen), of om de diagnose bij een ziektegeval vast te stellen (onderzoek klinisch materiaal). Dit kwalitatieve onderzoek geldt voor ziekteverwekkende (pathogene) micro-organismen.



  • Men wil het aantal micro-organismen bepalen.

In de meeste gevallen mogen micro-organismen (tenslotte zijn micro-organismen overal) wel in een monster voorko­men maar in beperkte aantal­len. Ook wil men graag de concentratie levende cellen in een suspensie of een cultuur weten. In deze gevallen is de bepaling van het aantal cellen noodzakelijk. Dit momster kan een levens­middel zijn, urine van mens of dier, het oppervlak van een aanrecht, oppervlaktewater etc.

In veel gevallen is een groot aantal micro-organismen ongewenst: een risico voor de gezondheid van de consu­ment, een teken van ziekte, een teken van een slechte hygiene, ongeschiktheid als zwemwater.

Het zal duidelijk zijn dat op veel laboratoria dagelijks bepalingen worden uitgevoerd om het aantal micro-organis­men te bepalen.

In de rest van deze module worden de verschillende metho­den en hun toepasbaarheid in verschillende situaties besproken. Ook wordt het rekenen met de verschillende methoden besproken en komen hier veel oefeningen over zodat je aan het eind van de module de berekeningen hopelijk foutloos kunt uitvoeren : een onmisbare eigenschap voor een microbiologisch analist!



2Onderscheid totaaltellingen en levendtellingen

Men kan hetzij het totale aantal kweekbare en niet kweek­bare micro-organismen hetzij het aantal levende micro-organismen bepalen. De eerst genoemde bepaling telt zowel de levende (tot groei in staat zijnde) als de dode cel­len, de tweede methode telt alleen de cellen die tot groei in staat zijn: de levende cellen


  1. .Methoden totaaltellingen

3Microscopische tellingen.

Door het te bepalen monster onder de microscoop te bekij­ken kan men het totale aantal m.o. per gram of per ml te weten komen. Belangrijk is hierbij dat men weet welke hoeveelheid er geteld wordt als men door de microscoop kijkt en telt. Hiervoor zijn twee methoden.

3.1.1.De telling volgens Breed.

Men strijkt hiertoe een bekende hoe­veel­heid monster op een objectglas en wel over een opper­vlak waarvan de afmetingen bekend zijn. Van het vloeibare monster wordt een zeer kleine hoeveelheid bijvoorbeeld 0,01 ml op 1 cm2 van een objectglas gebracht.

Is het te onderzoeken materiaal een vast (niet vloeibaar) product dan dient dit eerst gesuspendeerd te worden. De verdunning die ontstaat door het suspende­ren moet men noteren, waarna men net zoals bij een vloeibaar product te werk kan gaan.

Vervolgens wordt het uitstrijkje gefixeerd en gekleurd net zoals een ander microbiologisch preparaat.

Bij het microscoperen en bekijken van het preparaat telt men het aantal cellen per microscoopveld. De diameter van dit veld is voor elke vergroting bekend, dus ook het oppervlak. Men weet nu dus het aantal cellen op een bekend oppervlak en men weet ook de vloeistof die is opgebracht op een bekend oppervlak. Met deze gegevens is het moge­lijk uit te rekenen hoeveel cellen er per ml of per gram monster aanwezig zijn.
Hieronder een oefenopgave. Probeer deze eens te maken, lukt dit niet geen nood! deze opgave wordt klassikaal besproken. Achterin dit hoofdstuk staan nog meer oefenin­gen en een apart blad met de antwoorden. Deze opgaven worden niet meer klassi­kaal besproken, uiteraard kun je hierover wel de docent raad­plegen als je het goede ant­woord niet hebt, neem dan wel je eigen berekeningen mee zodat de denkfout of rekenfout kan worden opgespoord.
Oefenopgave Telling volgens Breed
Men strijkt 0,01 ml monster uit op 1 cm2, droogt, fixeert en kleurt het geheel. Daarna wordt het onder de micro­scoop bekeken. Men ziet 12 cellen per microscoop­veld. De diameter van een microscoopveld is 0,16 mm.

Hoeveel cellen zijn er per ml aanwezig?


Uitwerking opgave:

3.1.2.Telling met behulp van een telkamertje




Bij deze microscopische telling brengt men het monster in een telkamertje. Dit is een speciaal soort objectglas waarin zich een vierkante ruimte bevindt waarvan de diepte bekend is en waarop de bodem een zodanige verde­ling met ingegraveerde lijnen is aangebracht, dat er vierkantjes ("hokjes") ontstaan met een bekend oppervlak.

Deze holte wordt geheel gevuld met het te onderzoeken monster of een suspensie ervan. Er wordt een dekglas op aangebracht (vaak met klemmetjes) en door de microscoop wordt het aantal cellen in een groot aantal vierkantjes geteld. Weet je het gemiddelde aantal per vierkantje dan is uit te rekenen hoeveel cellen er per ml aanwezig zijn omdat het volume van een vierkantje bekend is.


Hieronder volgt een oefenopgave:
Oefenopgave tellen m.b.v. een telkamer
In een telkamer met een diepte van 0,1 mm en vierkante hokjes met zijden van 0,05 mm wordt een gistsuspensie ge­bracht.(zie ook bovenstaande figuur)

Men telt gemiddeld 12 gisten per hokje. Hoeveel gisten zijn er dan in 1 ml?


Uitwerking opgave:

4Indirecte totaaltellingen

Behalve de directe of microscopische totaaltellingen waarbij de micro-organismen echt telt, kan de hoeveelheid cellen ook indirect worden bepaald. Dit kan met de in deze & beschreven methoden.

4.1.1.Coulter Counter

De Coulter Counter is een apparaat dat het aantal (in een bepaald volume) registreert.

Het hart van het apparaat bestaat uit een kleine ruimte met daarin een membraan waarin zich een kleine porie bevindt. Over de membraan heerst een potentiaalverschil, dat continue gemeten wordt en te zien is op een beeld­scherm. Men laat vervolgens een monster passeren, d.w.z. de te tellen cellen verdund in een geleidende vloeistof. De deeltjes = cellen passeren 1 voor 1 de membraan door de porie. Bevindt zich een deeltje in de porie dan wordt het potentiaalverschil heel even verhoogd; er is een pulsje te zien op het beeldscherm, daarnaast telt het apparaat ook de hoeveelheid pulsjes.

De oorzaak van een pulsje is het feit dat een cel een hogere weerstand heeft dan de vloeistof waarin het zich bevindt. Een hogere weerstand leidt tot een hoger poten­tiaalverschil.

Zo is er zelfs een verband tussen de grootte van het deeltje en de hoogte van het pulsje, waardoor het moge­lijk is door het instellen van een benedengrens en een bovengrens aan de afmetingen van de te tellen pulsjes om alleen cellen van een bepaalde grootte te tellen.

Het is een zeer snelle, nauwkeurige methode.

Een nadeel van de methode is dat de deeltjes niet echt gezien worden, stofdeeltjes en andere troep kunnen ook als deeltje meegeteld worden. De Coulter Counter wordt dan ook gebruikt voor grote aantallen vergelijkbare monsters zoals bij bloed- en melkonderzoek.

Zie ook proef ...natuurkunde

4.1.2.De meting van de troebeling van een suspensie (turbidimetrie)

Hoe meer cellen (deeltjes) in een vloeistof hoe troebeler de vloeistof is. Van deze eigenschap kan men gebruik maken om d.m.v. de troebelheidsmeting te bepalen hoeveel micro-organismen er per ml in een vloeistof zitten. Deze troebelheidsmeting voert men uit in een spectrofotometer door bij een bepaalde golflengte de extinctie (absorptie) te meten. Hoe meer cellen hoe meer licht wordt ver­strooid en hoe minder licht wordt gemeten (d.w.z. hogere extinctie). Als blanco dient de vloeistof waarmee de sus­pensie is gemaakt of het medium waarin de cellen zijn gegroeid. Tot een bepaalde concentratie cellen is er een rechtlijnig verband tussen de extinctie en het aantal cellen per ml. Deze methode heeft als voordeel dat het een zeer snelle methode is, een nadeel is dat de methode alleen gebruikt kan worden voor (suspensies van) reincul­tu­ren. Toch komt het wel voor dat men op een lab van een reincultuur wil weten wat de concentratie cellen is. Van zo"n bekende (!) reincultuur moet je dan in een eerder stadium al eens een ijklijn gemaakt hebben om bovenge­noemd verband vast te leggen. Heb je eenmaal deze ijklijn dan is een enkele meting voldoende om vast te stellen hoeveel (dode en levende) cellen er per ml aanwe­zig zijn.


Het maken van de ijklijn
Om van een bepaald micro-organisme het verband tussen extinctie en concentratie cellen te weten te komen moet men van deze cultuur van een aantal concentraties telkens twee metingen uitvoeren: een extinctiemeting en een andere meting bijvoorbeeld een van de bovengenoemde andere totaaltellingen.

Wil men van een cultuur graag het verband tussen extinc­tie en het aantal levende cellen per ml weten, wat vaak veel interessanter is, omdat de levende cellen gebruikt kunnen worden voor allerlei onderzoek, dan zal bij de ijklijn naast de extinctiemeting een levendtelling moeten worden uitgevoerd. Wil men deze ijklijn gebruiken bij een latere absorptiemeting om snel het aantal levende cellen per ml te weten te komen dan is het heel belang­rijk dat de cultuuromstandigheden van de te onderzoeken reincultuur exact hetzelfde zijn als die van de ijklijn. Zo weet je vrijwel zeker dat het % levende cellen in de cultuur vergelijkbaar is (je telt met de extinctiemeting immers de levende en de dode, terwijl je alleen in de levende geïnteresseerd bent).

Zie ook BPV 6.

De McFarlandschaal

Een snelle manier waarbij geen instrument nodig is om de troebelingsgraad van een cultuur vast te stellen is de suspensie te vergelijken met een reeks standaardbuizen met een bepaalde oplopende troebe­lingsgraad. Dit wordt de McFarlandschaal genoemd. Deze buizen kan men zelf maken maar zijn ook kant en klaar te koop.

Zie ook BPV opgaven.

4.1.3.Andere indirecte bepalingen om het aantal cellen vast te stellen

Soms gebruikt men andere methoden om de hoeveel celmate­riaal vast te stellen in plaats van een meting van het aantal cellen. Deze worden hieronder besproken:
A Bepaling gewicht
Het is mogelijk om van een cultuur na verwijdering van de vloeistof het gewicht te bepalen. De vloeistof raakt men kwijt door filtratie van de suspensie (of cultuur) of door centrifugeren. Na centrifugeren liggen de cellen zeer compact op de bodem van de buis, de zogenaamde pellet. Het is dan zelfs mogelijk de buis op de kop te houden en de bovenstaande vloeistof de zogenaamde supernatant af te gieten zonder dat de pellet meegaat!

Na afloop van filtratie weegt men het filtertje samen met de daarop liggende cellen. Na afloop van het centrifuge­ren weegt men de buis samen met de pellet. Na aftrek van respectievelijk gewicht filtertje of gewicht centrifuge­buis heb je dan het zogenaamde versgewicht te pakken.

Wil men liever het drooggewicht te weten komen dan dienen filter en buis met bijbehorende cellen zolang gedroogd te worden totdat al het water verdwenen is en het gewicht constant blijft.
B Bepaling celcomponent
Een andere manier om een idee te krijgen van de hoeveel­heid celmateriaal is een chemische bepaling van een celcomponent. Deze celcomponent moet uiteraard wel een goede maat zijn, bijvoorbeeld een eiwitbepaling of een stikstofbepaling, deze stoffen komen in een vrij constant % in de bacteriecel voor.

Een speciaal geval vormen de antigenen die zich op flagel en celwand bevinden. Ook hiervan kan men de hoeveelheid bepalen , zelfs zeer specifiek! Deze bepalingen vallen bij ons op school onder de immunologie.



C Bepaling stofwisselingsproduct

Soms kan de hoeveelheid (aanwezigheid) van een bepaalde door het micro-organisme gemaakte stof een maat zijn voor het aantal cellen. Bijvoorbeeld de hoeveelheid gevormd zuur.

Een ander stofwisselingsproduct is bacterietoxine. Dit toxine is in sommige praktijkgevallen nog belangrijker dan het aantal cellen. Zo kunnen cellen allang dood en gelyseerd zijn, terwijl het toxine nog aanwezig is en zal het levensmiddel waarin het toxine zich bevindt bij consump­tie een gevaar voor de consument kunnen zijn. Omdat toxinen goede antigenen zijn worden ze meestal ook immunochemisch bepaald


  1. Methoden levendtellingen

Onder levende micro-organismen verstaat men de mi­cro-organis­men die tot groei in staat zijn. Deze groei is op het lab zicht­baar te maken op een vaste voedingsbo­dem waarop kolonies ontstaan. Deze voedingsbodem kan een algemene voedingsbodem zijn waarop zo veel mogelijk micro-organismen kunnen groeien, men spreekt dan van een zogenaamd totaal kiengetal. Een lab kan ook geïnteresseerd zijn in een bepaalde soort of groep micro-organis­men, dan kiest men voor een selectieve voedingsbodem. Hierin bevinden zich stoffen die de andere micro-organis­men die niet geteld hoeven te worden in hun groei remmen. Deze micro-organismen die dus eigenlijk "in de weg" zitten bij de bepaling vormen dan geen kolonies en worden dus niet meegeteld. Afhankelijk van de ge­bruikte selec­tieve voe­dingsbodem en het doel van de telling telt men alle kolonies die groeien of alleen de gezochte kolonies die zichzelf 'verraden' door een specifiek, herkenbaar uiter­lijk. Voedingsbodems die een specifiek uiterlijk aan de tellen kolonies geven noemt men electief. Vaak is er sprake van een combinatie, dus op de selectieve plaat zijn de gezochte kolonies aan hun uiterlijk te herkennen, er moet dan wel deskundig personeel zijn die een onder­scheid kan maken tussen de gezochte soorten en de andere micro-organismen.

Ook zijn tellingen met een vloeibaar medium mogelijk, de groei is dan zichtbaar door troebeling of als men speci­fieke micro-organismen wil tellen door op gasvorming of zuurvorming te letten. Ook hier kan men gebruik maken van selectieve en/of electieve voedingsmedia.



5 Voorbereidingen voor het onderzoek
Microbiologisch onderzoek vergt altijd voorbereidingen, vooral omdat alle benodigdheden steriel moeten zijn. Je moet dus van te voren weten wat je allemaal nodig hebt. Maak hiervan een lijstje. Het handigste is om een schema te tekenen van de proef, zie Microbiologie Praktijk. Je kunt dan zien wat je nodig hebt aan pfz, flesjes, buizen, pipetten en medium.

A Het homogeniseren



Een vast monster

Voordat het eigenlijke onderzoek begint moet een vast product gesuspendeerd en gehomogeniseerd wor­den, anders kan het niet gepipetteerd worden, een vast monster kan dus nooit onverdund worden onder­zocht.

Er wordt een bepaald hoeveelheid monster, bijvoorbeeld 10 gram van een gebakje bij een bekend volume verdunnings­vloeistof bijvoor­beeld 90 ml pfz gebracht.

Pfz is een afkorting voor pepton-fysiologisch zout. In deze oplossing overleven de te bepalen micro-organismen beter dan in water.

Vervolgens worden monster en vloeistof zeer goed gemengd waar­bij het gebakje in kleine stukjes uiteenvalt en de micro-organismen vanaf het product de vloeistof ingaan. Dit suspenderen gebeurt in een steriele mixer of in een stomacher.

Een stomacher is een suspendeerapparaat waarin een plas­tic zakje kan worden gehangen. In dit zakje bevindt zich het afgewogen monster en de verdunningsvloeistof. Sluit je het apparaat dan kun je het aanzetten en gaan twee ijzeren plaatjes in een hoog tempo om de beurt op het zakje drukken. Daarna is het monster pipetteerbaar en geschikt om onderzocht en/of verder verdund te worden.


Een vloeibaar monster

Een vloeibaar monster kan in prin­cipe direct worden onder­zocht, vergeet echter nooit goed te schudden, de kans is groot dat de kleine beestjes op de bodem liggen en zonder te schudden zit je dan de 'lege' bovenstaande vloeistof te onderzoeken!!!

Vaak zitten er zoveel micro-organis­men per ml in zodat na schudden eerst verdund moet worden.

B. Het aanleggen van een verdunningsreeks

Om een betrouwbaar resultaat te krijgen is het noodzake­lijk om tijdens het maken van een verdunningsreeks mon­ster en verdunningen goed te mengen en bij elke verdun­ningsstap een nieuwe pipet te nemen.

6Tellingen m.b.v. een vaste voedingsbodem

Deze tellingen worden ook wel plaatmethode of kiemgetal­bepaling genoemd. Gemeenschappelijk is dat het monster of een bekende verdunning ervan op of in een vaste voedings­bodem gebracht wordt. Na incubatie worden het aantal kolonies geteld en kan men via de aangelegde verdunningen terugrekenen hoeveel micro-organismen per ml aanwezig zijn. Uitgangspunt bij deze bepaling is dat één micro-organisme één kolonie veroorzaakt.

6.1.1.Mengplaatmethode en strijkplaatmethode

Het verschil tussen mengplaat en strijkplaatmethode is als volgt:

Bij een mengplaat wordt 1 ml monster (of een verdunning ervan) in een petrischaal gebracht en daarna wordt hand­warm agarhoudend medium toegevoegd, goed ge­mengd waarna het medium stolt.

Bij een strijkplaat staan de goed gedroogde (waarom?) platen al klaar en wordt 0,1 ml van het monster (of een verdun­ning ervan) met een glazen hockeystick (drigalski-spatel) goed uitgestreken over het agaroppervlak.

Kiemgetallen worden bijna altijd in duplo ingezet, dus twee platen per verdunning




6.1.2.De beoordeling van de platen

Welke platen worden geteld?

Na incubatie wordt het aantal kolonies per plaat geteld.

De 'ideale' plaat bevat tussen de 30 en 300 kolonies. Minder als 30 is statistisch gezien minder gunstig. Boven de driehonderd kolonies is de kans groot dat 1 kolonie door meer dan één bacteriecel is ontstaan ('overcrowding').

Is zo'n ideale plaat niet aanwezig dan moeten we roeien met de riemen die we hebben. Dus dan maar de platen met een paar kolonies tellen! Vervelender wordt het als we alleen platen met zeer veel kolonies tot onze beschikking hebben. Zijn het er zeer veel dan kan een kwart van de plaat geteld worden. Zit de plaat echt stampvol (boven de duizend kolonies) dan kan men op elke plaat twee keer het aantal kolonies op 1 cm2 tellen. Het gemiddelde hiervan bij een standaard petrischaal (diameter 9 cm) wordt verme­nigvuldigd met een factor 100 en de verdunningsfac­tor en de uitkomst hiervan is het kiemgetal. Wel altijd vermelden dat het een overgroeide plaat betreft. Toch is zo'n uitslag altijd beter dan de vermelding 'niet te tellen. !
De factor tien

Als het goed is, zitten er tussen de decimale verdunnin­gen ook decimale verschillen in de uitkomsten op de platen. Breng je tien keer zo weinig monster op de plaat dan horen er ook tien keer zo weinig kolonies op de plaat te zitten. Let hier eens op, je kunt zo je eigen manier van werken beoordelen. Een uitzondering op de factor tien regel vindt men bij heel erg volle platen, hier zitten nooit tien keer zoveel op als de plaat als de tien keer lagere verdunning.(oorzaak?)

6.1.3.De berekening van het kiemgetal

Door het aantal kolonies te tellen van een verdunning van het monster weet je het kiemgetal. Het klinkt zo simpel maar in de praktijk worden er veel vergissingen meege­maakt. Achterin staan een aantal oefenopgaven.

6.1.4.Kolonievormende eenheden ( k.v.e's)

Het principe van de kiemgetalmethode is dat één micro-organisme één kolonie vormt. Dit is een theoretisch ideaal.

Er zijn veel kanttekeningen bij te plaatsen.

Bijvoorbeeld : de cellen vormen kluitjes of liggen in sliertjes, een kolonie ontstaat dan uit meerdere cellen. Groeien alle gezochte micro-organismen wel bij deze kweekomstandigheden?

Om deze discussies te voorkomen spreekt men niet over het aantal levende micro-organismen maar over het aantal kolonievormende eenheden.

6.1.5.Het noteren van het kiemgetal

Geef kiemgetallen beneden de 100 als zodanig op.

Geef hogere kiemgetallen als volgt op:


N = a * 10b
a is een getal met één cijfer voor en één cijfer ach­ter de komma

b is een geheel getal niet kleiner dan twee

Dus 2,5 * 106 per ml en niet 253 * 108 per ml

dus 72 per gram en niet 7,2 * 101 per gram

Vermeld ook altijd welke micro-organismen zijn geteld, dus coliformen, enterobacteriën, Bacillus cereus etc.

en daarnaast de kweekomstandigheden : incubatietijd, incubatietemperatuur en de gebruikte voedingsbodem.

6.1.6.Welke verdunningen worden er ingezet?

Achteraf bij het kolonietellen weet je eigenlijk pas wat de ideale verdunning voor het monster was. Omdat je uiteraard van te voren het kiemgetal niet weet, worden er meestal drie of meer opeenvolgende decimale verdunningen ingezet.

Anders wordt het, als men de afkeuringsgrens van het product voor het onderzochte micro-organisme kent. Met deze grens kun je uitrekenen welke verdunning laat zien of de grens wordt overschreden.

Hier gaan we ook klassikaal mee oefenen.

Uit ervaring weet men ook vaak hoeveel micro-organismen men in een bepaald product kan verwachten.
6.1.7.Stempel en swab methode voor het onderzoek van oppervlakken.

Ook oppervlakken kunnen met behulp van een vaste voe­dingsbodem op het aantal aanwezige micro-organismen worden onderzocht. Dit kan met speciale petrischaaltjes welke, nadat men er agarhoudend medium in heeft gegote­n, een stempelkussentje hebben welke op het te onderzoe­ken oppervlak gedrukt kan worden. Na incubatie is te zien of er op het oppervlak micro-organismen aanwezig waren en zo ja, hoeveel per cm2. Zo kan de hygiëne in bijvoorbeeld toilet­ruimtes , keukens of bedrijven worden onderzocht.

Dit stempelen kan uiteraard alleen bij vlakke oppervlak­ken gebeuren. Bij holle voorwerpen (lepels) moet je het voorwerp met een swab afwissen en vervolgens de swab uitschudden in een vloeistof. Waarna de vloeistof met de meng- of strijkplaat het kiemgetal kan worden bepaald.
6.1.8.Membraanfiltratie

Wil je grote hoeveelheden vloeistof op de aanwezigheid van kleine aantallen micro-organismen onderzoeken, dan doe je dat met behulp van een zogenaamd membraanfilter, welke wel de vloeistof maar niet de micro-organismen doorlaat. De cellen blijven dus achter op het filter welke op een vaste voedingsbodem gelegd wordt. Op het filter groeien dan na incubatie de kolonies, omdat de voedingsstoffen door het filter kunnen diffunderen. Voorbeelden hiervan zijn onderzoek van drinkwater en dranken.


6.1.9.Selectieve kiemgetalbepalingen.
Zoal al eerder besproken worden in de meeste gevallen is er altijd de keuze om van een monster een algemeen kiem­getal te bepalen of een selectief kiemgetal . Heel vaak worden selectieve tellingen uitge­voerd, dus op een speci­ale groep micro-organismen. In de tweede klas betreft het de volgende media:
Moutextract agar voor schimmels en gisten

Mannitol-zoutagar voor Stapphylococcen

Violet Red Bile Agar voor Coliformen

Violet Red BIle Glucose Agar voor enterobacte­riën

Baird Parker Agar voor Staphylococcus (aureus)

Tellurietagar voor Streptococcen

Deze worden in een volgende module besproken

7Telling met behulp van vloeibare media
Ook wel de verdunningsmethode van Pasteur of de MPN-methode genoemd (verklaring afkorting komt later). Het bekendste voorbeeld hiervan is de verdunningsmethode van hoge decimale verdunningen aangelegd en vervolgens wordt vanuit elke decimale verdunning in veelvoud in een vloei­baar (selectief en electief) medium 1 ml gepipetteerd. Vervolgens wordt na incubatie gekeken bij welke verdun­ning sommige bui­zen wel en andere buizen geen groei te zien geven , hieruit kan men afleiden hoeveel micro-organismen zich in het onverdunde monster bevonden.
Hier volgt en een beschrijving. Achterin staan oefenopgaven. Hieronder nog een opgave die klassikaal besproken wordt, ditmaal toegespitst op mon­sters waarin weinig micro-organismen verwacht worden of aanwezig mogen zijn. Ook kom te MPN tabel aan de orde
Van een monster (vloeibaar of vast) worden opeenvol­gende steeds 10 * zo kleine hoeveelheden ingezet. Er hoeft niet beslist met een verdunning worden begon­nen. Ook grote hoeveelheden monster kunnen worden ingezet. Bijvoorbeeld 100 ml, 10 ml, en 1 ml. Aan deze hoeveelheden wordt vloeibaar medium toegevoegd en na incubatie wordt op groei, en eventueel ook op gasvorming en/of zuurvorming beoordeeld.

De MPN methode is vooral zeer geschikt voor het aan­to­nen van kleine aantallen levende m.o. in bijvoor­beeld lei­dingwa­ter. Grote volumes aan monster worden ingezet (kan dit ook bij de bepaling van het kiemge­tal?) door er vloeibaar medium in geconcen­treerde vorm aan tot te voegen(of anders­om). Nadat extra geconcen­treerd medium en mon­ster aan elkaar toege­voegd zijn is de concen­tratie aan voedings­stoffen in de vloeistof weer gelijk aan de con­centraties in een normaal medium zodat de eventueel aanwezige m.o. kunnen gaan groei­en(voor zover de selecti­viteit van het medium dat natuurlijk toelaat).


Hieronder volgt een voorbeeld:
Op een drinkwaterbedrijf wordt leidingwater ingezet waarbij een monster in hoeveelheden van 1000,100 en 10 ml (elke hoe­veelheid in triplo) wordt onderzocht op colifor­men.

Bij elk monster wordt een 10 x zo klein volume aan zeer gecon­cen­treerd medium toegevoegd en een gasopvangbuisje (durhambuisje).


Vragen

a.Waarom wordt leidingwater=drinkwater juist op colifor­men onder­zocht?

Leg je antwoord goed uit.

b.Waarom worden zulke grote hoeveelheden onder­zocht?(mis­schien niet zulke grote volumes als in dit voorbeeld maar wel grotere volumes als bij andere watermonsters).

c.Waarom wordt het medium zo geconcentreerd toege­voegd en hoe­veel keer geconcentreerd is het t.o.v. het normale medium?

d.Zoek in je proevenbundel een geschikt medium en geef duide­lijk en overzichtelijk aan hoeveel je hiervan moet maken en afwegen voor de verschillende monsters.

e.Stel dat de proef na incubatie de volgende resul­taten te zien geeft wat is dan het MPN?(zie tabel op de volgen­de bladzijde).
Geef hier­bij een duidelijke uitleg,dus uit­leggen aan willekeu­rige open dag bezoe­ker.
de monsters van 1000 ml: alle drie troebel met gas­ontwik­ke­ling.

de monsters van 100 ml:een helder,twee troebel waar­van een met gasontwikkeling.

de monsters van 10 ml:alle drie helder.


8Presence/Absencetesten

Een speciale methode voor het onderzoek naar de aanwezigheid van micro-organismen is de bepaling op de aanwezigheid van een bepaald micro-organisme in een bepaalde hoeveelheid product. Deze bepaling wordt ook wel grensreactie genoemd of presence/ab­sence test genoemd,

Men gaat dan na of een bepaal micro-organismen te kweken is uit die bepaalde hoeveelheid pro­duct. De kwaliteitseis is bijvoorbeeld de afwe­zigheid van Salmonella in 25 gram of als men strenger is de afwezigheid in 250 gram. Deze hoeveelheid product moet dan worden ingezet.

Dergelijke testen worden vooral uitgevoerd voor ziekteverwekkende (pathogene) micro-organismen. Dus micro-organismen waarbij de risico's voor de consu­ment groot zijn.

Bij een dergelijke bepaling wordt er dus naar ge­streefd om ook al is er maar een enkele cel aanwe­zig deze toch aan te tonen. Men gaat niet kwantitief te werk door een telme­thode toe te passen, maar men gaat kijken of het micro-organismen te kweken is uit het product.

Zo'n bepaling bestaat meestal uit meerder stappen :

- een resuscitatie,

d.w.z. dat het monster in een alge­meen vloei­baar medium wordt gebracht

doel hiervan is beschadigde cellen te laten herstellen, zodat ze op de daaropvolgende se­lectieve media kunnen groeien

- een ophoping,

vanuit het resuscitatiemedium gaat een bepaalde hoeveelheid vloeistof over in het selectieve vloeibare ophopingsmedium

hierbij zijn de kwee­komstandigheden zoda­nig dat het gezochte micro-orga­nisme zich goed kan ontwikkelen en alle andere organismen die in het product zitten in hun groei geremd worden of gedood.

- een isolatie stap,

vanuit ophopingsmedium wordt overgeënt op een selectieve en tegelijkertijd electieve voe­dingsbodem. Het gezochte micro-organisme is hierop aan zijn groeiwijze = (kolonie)uiterlijk te herkennen,

- reinkweek van het gezochte micro-organisme

- bevestiging

de reinkweek wordt gedetermineerd door naar biochemische eigenschappen te kijken (bonte rij) en/of door immunochemisch onderzoek bij­voor­beeld een agglutinatietest


Het onderzoek kan meer of minder streng zijn, hoe strenger de eis, hoe meer product wordt ingezet waarin het micro-organisme niet aantoonbaar mag zijn. Dit maakt het onderzoek kwantitatief, reden om het hier te behandelen.

9Indirecte bepaling van het aan­tal le­vende micro-organis­men


Tegenwoordig zijn er ook snelle en/of arbeidsbespa­rende methoden om het aantal levende micro-organis­men te bepalen. Twee voorbeelden worden hieronder kort besproken.
9.1.1.De ATP-bepaling
Met deze bepaling wordt het ATP-gehalte van de mi­crobecel bepaald. Hierbij wordt gebruik gemaakt van het enzym luciferase- geïsoleerd uit het vuurvlieg­je- dat het substraat luciferine oxideert en daarbij licht uitzendt.

Deze reactie vereist de aanwezigheid van ATP.

Hoe meer ATP, hoe meer licht!

Voegt men dus aan een monster het luciferine en het luciferase toe en meet men daarbij de hoeveelheid licht, dan is na te gaan hoeveel ATP er in het mon­ster zit.

De methode is niet erg gevoelig , er moeten wel 100.000 micro-organismen aanwezig zijn om iets te kunnen meten.

Het is wel een zeer snelle methode ! Binnen een minuut is er een uitslag. Vergelijk dit eens met andere levendtellingen!

Wel wordt ook ATP gemeten van andere levende cellen!

Dit kan van voedselresten zijn of door afdruk van handen. Voor hygiënemetingen is dit bezwaar niet zo groot. Voedselresten mogen na schoonmaken ook niet aanwezig zijn, ze vormen een groeimogelijkheid voor mi­cro-organismen en zijn dus ongewenst.

Wil men alleen prokaryoot DNA bepalen, dan is dat zelfs ook mogelijk, er moet dan aan het monster als voorbehandeling een enzym (somase) toegevoegd worden wat alle eukaryote DNA afbreekt.

9.1.2.De bactometer


Deze methode maakt gebruik van het feit dat t.g.v. bacteriële groei de chemische samenstelling van het medium verandert waardoor de geleidbaarheid toe­neemt.

Een waarneembare verandering treedt pas op al het aantal micro-organismen de grens van 106 bereikt. De tijd die voor een monster nodig is om dit punt te bereiken noemt men de detectietijd. Deze hangt af van de hoogte van de besmetting in het monster. Door van een groot aantal monsters zowel het kiemgetal te bepalen als de detectietijd kan men een grafiek (re­gressielijn maken die het verband aangeeft tussen deze twee. Weet men dit verband dan kan voor de volgende monsters (van hetzelfde type) volstaan worden met het bepalen van de detectietijd.

De resultaten zijn vaak binnen een dag bekend.

Een andere toepassing is het zogenaamd wegscreenen van mon­sters.

Grote aantallen binnengekomen monsters worden eerst bepaald op hun detectietijd door ze aan het eind van de dag in te zetten en de volgende dag 's morgens af te lezen. Alleen van de 'verdach­te' monsters, dus met een korte detectietijd worden dan nog kiemgetal­len ingezet. Een grote besparing op materiaal en ar­beid. Voor de analist is het ook dankbaarder werk: men heeft niet het gevoel voor niets onderzoek te doen.

Een nadeel is de grote investering, een apparaat waarmee de detectietijd bepaald wordt kost enkele tonnen.


Leerdoelen Telmethoden

De leerling kan aan het einde van de lessen:




  • een aantal veel gebruikte methoden om micro-organis­men te tellen noemen en be­schrij­ven

  • en uitleggen wat de overeenkomsten en verschillen tussen deze metho­den zijn

  • het betreft microscopische telmethoden, levendtel­lin­gen op/in vaste voe­dingsbodem, MPN methode, tur­bidi­metrie, Coulter Counter, ATP me­ting, bepalingen van het gewicht(droog/vers),

  • uitleggen op welk principe bioscreen en bactometer gebaseerd zijn en welke toepassin­gen deze apparaten kennen.

  • aangeven en motiveren welke methode het geschiktst is voor een bepaal­de situatie.

  • de gegeven resultaten van een bepaalde telling omre­kenen in het aantal micro-organis­men per gram of ml.

  • bij een gegeven concentratie micro-organismen aange­ven op welke wijze , of en zo ja met welke verdun­ningen, de telmetho­de moet worden ingezet

9.1.3.Oefenopgaven


Bij deze moduletekst zijn er de volgende oefenin­gen.

In veel gevallen staan de antwoorden letterlijk in de tekst. In andere gevallen worden er rekenopgaven gegeven. Last but not least! wordt je in enkele oefeningen gevraagd om de methoden met elkaar te vergelijken, en hun toepassingen te bespreken. Leg ook verbanden met het practicum en de projectblokken, en gebruik als naslagwerk Microbiologie Technieken.




Bij 1.1 Waarom is deze leerstof zinvol?
vr.1 Waarom wordt in het ene geval onderzocht of er een micro-organisme aanwezig is en wordt in het andere geval geteld hoeveel micro-organismen er zijn?
vr 2 Welke redenen kunnen er zijn om het aan­tal micro-organis­men ergens in of op te bepalen? Bedenk zelf zoveel mogelijk voorbeelden.
Vr 3 Stel dat je in urine bij een onderzoek naar blaas­ontsteking een bepaald micro-organisme aantreft : mag je zeggen dat dit micro-organisme de oorzaak is van de blaasontsteking?
Bij 1.2.Onderscheid totaaltellingen en levendtellingen

vr1 Wat is het verschil tussen een totaaltel­ling en een levendtelling?


vr2 Wat verstaat men in de praktijk onder levende micro-orga­nismen ?
vr3 Wat verstaat men in de praktijk onder dode micro-organismen ?
Bij 2.Methoden totaaltellingen


Bij 2.1.1.Telling volgens Breed

vr1 Welke gegevens zijn nodig bij de telling van Breed om het aantal micro-organisme per ml uit te kunnen rekenen?


vr2 Van een monster melk wordt 0.01 ml uitgestre­ken op 4 cm2 en na kleuring onder de microscoop bekeken.

De diameter van het microscoopveld is 0,20 mm. Men telt 1 cel per veld. Hoeveel micro-organismen zijn er per ml aanwezig?


vr3 Uit het antwoord van de vorige vraag kun je afleiden vanaf welke concentratie micro-organismen de telling van Breed te gebruiken is. Vind je dit een gevoelige methode?
vr 4 Van een monster melk wordt 0.02 ml uitgestre­ken op 4 cm2 en na kleuring onder de microscoop bekeken.

De diameter van het microscoopveld is 0,20 mm. Men telt 10 cellen per veld. Hoeveel micro-organismen zijn er per ml aanwezig?


2.1.2. Telling met behulp van een telkamertje

vr5 Welke gegevens zijn nodig bij de telling m.b.v. een telkamertje om het aantal micro-organismen per ml uit te kun­nen rekenen?


vr6 In een telkamer met een diepte van 0,1 mm en vier­kante hokjes met zijden van 0,05 mm wordt een gist­suspensie ge­bracht.

Men telt gemiddeld 18 gisten per hokje. Hoeveel gisten zijn er dan in 1 ml?


vr7 Hieronder staat een telkamer afgebeeld met daarin bacteriën. Veel bacteriën liggen op een rand van een vakje. Hoe ga je bij het tellen te werk om te voor­komen dat je deze cellen dubbel telt?
vr8 Een monster melk wordt in een telkamer gebracht en na onder de microscoop bekeken.

Men telt 1 cel per vierkantje met zijden van 0.05 mm. Hoeveel micro-organismen zijn er per ml aanwe­zig?


vr9 Uit het antwoord van de vorige vraag kun je afleiden vanaf welke concentratie micro-organismen de telling m.b.v. een telkamer te gebruiken is. Vind je dit een gevoeli­ge methode?
vr10 Als je de Breedtelling vergelijkt met de telkamermethode voor de telling van een levensmiddel wat is het voordeel van de Breedtelling?
2.2.1. Coulter Counter
vr1 Leg uit hoe een Coulter Counter cellen kan tel­len: denk hierbij aan de bouw en de werking.

Bespreek voordelen en nadelen van deze methode.

Welke toepassingen kent deze methode?
2.2.2.Troebeling (in combinatie met vorige onderwerpen)
vr1 In welke situatie is het handig of nodig om de troe­belheid van een cultuur te bepa­len?
Vr2 Bespreek uitgebreid op welke wijze je het ver­band tussen de extinctie en het totale aantal cellen per ml van een gistsuspensie kunt bepalen, je hebt al­leen pfz, glaswerk ,een brokje persgist, een telka­mer, en een spectrofotometer en water tot je beschik­king.
2.2.3 Andere indirecte bepalingen en vorige onderwerpen)
Vr1 Hoe kun je bepalen hoeveel (dode + levende) bacte­riecellen van bij­voorbeeld Escherichia coli er in een gram gaan?
Vr2 Naast het wegen van micro-organismen zijn er nog meer methoden om het totale aantal cellen per ml te bepalen? Zet alle metho­den voor een totaaltel­ling nog eens op een rijtje. Bespreek de voordelen en de nadelen.
Vr3 Welke stoffen in de bacteriecel zijn een goede maat­staf voor het aantal cellen ( de hoeveelheid celma­te­riaal)?
Vr4 In welke gevallen kan men deze (in vraag 2 behandelde) bepalingen toepassen?

a: aantal micro-organismen in een slagroompunt

b: aantal micro-organismen in een bacteriesuspensie

c: bepaling micro-organismen in oppervlaktewater


vr5 Wat is het voordeel van een McFarlandschaal boven een spectrofotometer?
Vr6 In welke gevallen bepaalt men liever het toxine als de bacterie die tot deze toxinen vormt?
Vr7 Wat is het voordeel van een immunochemiche bepaling?


Bij 3.Methoden levendtellingen


Vr1 Wat is een algemene voedingsbodem? Noem een voor­beeld uit de praktijk(les).


vr2 Wat is een selectieve voedingsbodem? Noem twee voor­beelden uit de praktijk(les) en leg de werking uit.
vr3 Wat is een electieve voedingsbodem? Noem twee voor­beelden uit de praktijk(les) en leg de werking uit.
vr4 Waarom worden er op een lab voor de bepaling van het kiemgetal zowel algemene als selectieve media ge­bruikt?
vr5 Noem alle voorbereidingen die nodig zijn voordat het kiemgetal kan worden bepaald van een kroket.
vr6 Waarom is schudden zo belangrijk bij bepalingen van het aantal micro-organismen? Wat is meestal het gevolg van slecht of niet schudden voor de uitslag van de bepaling?
vr7 Wat is een stomacher? Wat is de functie ervan (wat doet hij met het monster?)

vr8 Van een monster water wordt m.b.v. de mengplaatme­thode(1 ml per plaat) een zoge­naamd aeroob kiemgetal ingezet.Om­dat er veel bac­te­rien verwacht worden worden er hoge verdunnin­gen ingezet.


De resultaten zijn als volgt:


Verdunning

Aantal kolonies plaat1

Aantal kolo­nies

plaat 2


10.000 x

2400

1800

100.000x

390

320

1000.000x

53

51

10.000.000x

4

3

Proefomstandigheden:

medium:Plate Count Agar,mengplaat (1ml per plaat),ae­robe incu­batie

incubatietemperatuur:30 C

incubatietijd:48 uur
Vragen:

a.Welke micro-organismen worden hier precies geteld?

b.Waarom mag je in dit geval de 10.000 x verdunning ook wel 10-4 noemen ?

c.Maak een werkschema:wat is er allemaal nodig voor de bepa­ling? denk aan aantal pipetten, aantal buizen en flesjes pfz, hoeveelheid medium.

d.Wat is het aeroob kiemgetal? Geef berekeningen en ver­klaar.
vr9 Achteraf blijkt de analist van opgave 8 een vergis­sing gemaakt te hebben:in plaats van 1 ml heeft hij telkens 0,1 ml in de platen gepipet­teerd.(De verdun­ningen zijn wel op de juiste wijze aange­legd).Hij komt na het maken van de mengplaten achter zijn vergis­sing en zet de platen wel in de stoof.
Vragen:

a.Wat is onder deze omstandigheden het kiemgetal?dus uitgaande van de hier beschreven vergissing en de in opgave 1 genoemde resultaten.

b.Mag je nu de 10.000 keer verdunning ook 10 -4 noe­men?

(het gebeurt vaak wel, maar wat is er zo verwarrend aan in het laatste voorbeeld?)

vr10 Hoe kun je op vaste voedingsmedia toch grote hoe­veelheden vloei­baar monster onderzoeken? beschrijf en leg uit.

Welke beperkingen kent deze methode? Verklaar.

vr11 Van een overnachtcultuur schat men dat het aantal micro-organismen per ml 109 bedraagt.

Men wil het kiemgetal bepalen : welke verdunningen moet men aanleggen ? Wat is er allemaal nodig, maak een kiemplaatschema.


vr12 In schepijs mogen niet meer dan 104 coliforme k.v.e's per ml aanwezig zijn. Hierop wordt het ijs onder­zocht: dus men gaat onderzoeken of er niet meer dan 104 k.v.e.'s aanwezig zijn. Hiervoor hoeft men maar één verdunning in te zetten! Welke? beredeneer dit, ga hierbij uit van de mengplaatmetho­de.
vr13 In welke gevallen wordt de membraanfiltermethode ge­bruikt?
vr14 Vergelijk de gietplaat en de strijkplaatmethode met elkaar: noem van beide de voordelen en de nadelen.
vr15 Waarom spreekt men bij de uitslag van een kiemgetal liever van kolonievormende eenheden dan van micro-organismen?
vr16 Vergelijk de swabmethode en de afdrukmethode met el­kaar, noem de voordelen en de nadelen.
vr17 Welke mon­sters worden op het lab met de MPN-methode bepaald? Wat is hier de reden voor?

vr18 Van het bovengenoemde watermonster met het kiemgetal berekend bij vr 9 wordt een MPN bepaling uitge­voerd.


Vragen:

a.Welke drie verdunningen worden in dit concrete geval bij voor­keur ingezet?Waarom?

Welke verdunningen hoeven niet ingezet te worden?

Maak ter verduidelijking een inzetschema van de proef(met namen en hoeveelheden).

Weet je ook een geschikt medium?Waarom is dit medium zo ge­schikt?

b.Als de door jou onder 3a genoemde verdunnin­gen van laag neer hoog bij het in drievoud inzetten van 1 ml het volgende resul­taat te zien geven:


laagste verdun­ning 3 troebele buizen

middelste verdunning 1 troebele buis

hoogste verdunning 0 troebele buizen
Wat is dan ongeveer het aantal coliformen per ml? Be­rede­neer ja antwoord.Er komt geen tabel aan te pas!

c.Met een tabel kan men het MPN van een monster bepalen.

Waar is MPN de afkorting van?

Wat betekent dat?

Wat is het MPN van bovengenoemd monster?
vr19 Van een monster wordt van de 1:100, 1:1000 en 1:10.000 verdun­ning in drievoud 1 ml ingezet op vloeibaar medium.

Het resultaat is:

1:100 : 2 positieve buizen

1:1000 : 1 positieve buis

1:10.000: 0 positieve buizen

Wat is de MPN?


vr20 In een monster zitten vermoedelijk 10.000 micro-orga­nis­men per ml. Welke verdunningen moeten dan bij de MPN worden ingezet om een goed resultaat te kun­nen aflezen in de tabel? of zonder tabel een schat­ting te kunnen maken?
vr21 Vergelijk de verdun­ningsmethode (MPN-methode) met de meng- of strijk­plaatme­thode : denk aan bewerkelijk­heid en gevoelig­heid.

Bij 3.5. Indirecte bepaling van het aantal levende mi­cro-orga­nismen

vr1 Bij de ATP bepaling wordt de hoeveelheid licht geme­ten. Hoe wordt dit licht gevormd? :

Geef een reactie­vergelijking ( geen structuurformu­les, maar namen van de reagentia) waarin vermeld staat wat er alle­maal nodig is voor de vorming van dit licht.
vr2 Wat is zijn twee uitgesproken voordelen van deze me­thode?
vr3 Wat zijn de twee nadelen? Zijn beide nadelen even "erg" ? zijn er ook argumenten om het ene nadeel juist een voordeel te noemen?
vr4 Wat zijn de voorde­lem van de impediometrie (bv. bactome­ter) vergeleken met de klassieke tel­plaatme­thode?
vr5 Welke voorbereidingen moet men eerst hebbem uitge­voerd voordat men een bactometer routinematig voor een bepaald monster en een bepaald micro-organisme kan inzetten?


Over de de hele module:
vr1 Wat zijn van beide microscopische methoden de nade­len vergeleken met een niet-mi­crosco­pische totaal­telling?
vr2 Zijn er ook voordelen vergeleken met een niet-mi­crosco­pische totaaltelling?
vr3 Wat zijn de voordelen van een totaaltelling boven een kiemgetal of MPN methode?
vr4 Men heeft een telkamertje met eendiepte van 0,1mm en vierkante telhokjes met zijden van 0,05 mm. Per hokje treft men gemiddeld 12 gisten aan. Hoeveel gisten zijn er per ml aanwezig?
vr5 Van bovengenoemde gistsuspensie wil men het kiemgetal bepalen. Welke verdunningen zal men kiezen? Hoe kun je na telling van het aantal kolonies uitrekenen wat het % levende gistcellen in het monster was? Geef een getallenvoorbeeld, bijvoorbeeld hoeveel kolonies je aantreft in de door jou uitgerekende ideale ver­dunning als 80% van de gisten in leven is.
vr6 In bijna alle gevallen gebruikt men als verdun­nings­vloeistof een vloeistof waarin NaCl is opge­lost. Wat is de reden hiervoor?
vr7 In veel gevallen wil men graag op het moment zelf weten hoeveel levende cellen er (per ml) in een cul­tuur zit­ten of er in ieder geval een schatting van kunnen maken.
Vraag a. In welke gevallen is dat zo?
Het probleem is dat de uitslag van een levendtelling bijna nooit direct bekend is :
Vraag b. Waarom niet?

Als de uitslag dan eindelijk wel bekend is is de te bepalen cultuur al weer zoveel ouder dat de kans groot is dat het aantal levende cellen per ml sterk gedaald is en weet men dus nog niets.

Daarom proef 15 , zie proevenbundel. Hieronder een getallenvoorbeeld.
Een 24 uur oude gistcultuur in moutextractbouiilon wordt onderzocht op het aantal levende cellen door er een kiemgetal van te bepalen:

Men onderzoekt de 10-4, 10-5 en 10-6verdunning en vindt de volgende aantallen kolonies op mengplaten mout­agar (30 C):




Verdunning

Aantal kolonies

10-4

850 en 900

10-5

120 en 132

10-6

10 en 14


Vraag cWat is het kiemgetal?
Vervolg op volgende bladzijde!!!!
Van dezelfde cultuur wordt tegelijk met het inzetten van het kiemgetal een tweevoudige verdunningsreeks gemaakt en van elke verdunning de extinctie gemeten.
De resultaten zijn als volgt:


Verdunningen in moutbou­illon

Extinctie bij 620 nm

onverdunde cultuur

2,6

2 *

2,6

4 *

2,4

8 *

1,2

16 *

0,6

32 *

0,3


Vraag d.Waarom wordt er nu verdund in moutex­tract­bouillon en niet met pepton-fy­siologisch zout?
Vraag e.Maak een grafiek die voor dit micro-orga­nisme onder deze kweekomstandig­heden het verband aangeeft tussen absorptie en het aantal levende cel­len.
Een volgende keer vindt men bij een eveneens 24 uur oude gistcultuur een extinctie van 2,0 bij een 4 X verdunde cultuur.
Vraag f.Hoeveel levende cellen zijn er dan aanwezig?
Vraag g.Welke verdunningen moet men aanleggen voor een proef waarbij men 104 levende cellen per ml nodig heeft?


Het tellen van micro-organismen C.M.Wiersema




De database wordt beschermd door het auteursrecht ©opleid.info 2017
stuur bericht

    Hoofdpagina