Bio-accumulatie en effecten van zware metalen bij de karper



Dovnload 271.95 Kb.
Pagina1/5
Datum19.08.2016
Grootte271.95 Kb.
  1   2   3   4   5
Bio-accumulatie en effecten van zware metalen bij de karper

(Cyprinus carpio) onder labo- en veldomstandigheden.


Maarten Sanne

Eindverhandeling ingediend tot bekomen

van de graad van Licentiaat in de Biologie
Promotor: Prof. Dr. Lieven Bervoets

Co-promotors: Prof. Dr. Ronny Blust

Karen Van Campenhout

Academiejaar 2002-2003

Inhoudstafel

Lijst met gebruikte afkortingen

Samenvatting

1 Inleiding …………………………………………………………………………............................. 1

1.1 Probleemstelling ……………………………………………………………………………... 1

1.2 Zware metalen en hun effecten …………………………………………................................. 3

1.3 PCB’s & pesticiden …………………………………………………………………………... 9

1.4 Doelstellingen ………………………………………………………………………………... 12

2 Materiaal & Methoden ……………………………………………………………………………... 14

2.1 Testorganisme ………………………………………………………………………………... 14

2.2 Labo-experiment ……………………………………………………………………………... 15

2.2.1 Aquaria met muggenlarven …………………………………………………………..15

2.2.2 Aquaria met karpers …………………………………………………………………. 15

2.2.3 Blootstellingsperioden ………………………………………………………………. 17

2.3 Veldexperiment ………………………………………………………………………………. 17

2.3.1 Kooien met karpers ………………………………………………………………….. 17

2.3.2 Blootstellingsperioden ………………………………………………………………. 18

2.4 Bloedstalen & hematocrietbepaling ………………………………………………………….. 18

2.5 Dissectie van de vissen ………………………………………………………………………. 19

2.6 Bepaling HSI, conditiefactor,vers- en drooggewicht ………………………………………... 20

2.7 Digestie van de weefsels ……………………………………………………………………... 21

2.8 Verdunning van de opgeloste weefsels ………………………………………………………. 22

2.9 Analyse van de stalen ………………………………………………………………………... 22

2.9.1 Bepaling van Cd-gehalten met GF-AAS ……………………………………………. 22

2.9.2 Bepaling van zware metalen met ICP-AES …………………………………………. 22

2.9.3 Bepaling van ionenconcentraties en osmolariteit in bloedstalen ……………………. 23


2.9.4 Bepaling PCB’s en OCP’s in de spieren …………………………………………….. 23

2.9.5 Bepaling acetylcholinesterase-activiteit in de hersenen …………………………….. 23

2.9.6 Bepaling eiwitgehalte in de hersenen ……………………………………………….. 24

2.9.7 Bepaling MT-gehalte in de lever ……………………………………………………. 25

2.10 Statistische verwerking resultaten ………………………………………………………….. 26

3 Resultaten …………………………………………………………………………………………... 27

3.1 Cd-accumulatie in labo ………………………………………………………………………. 27

3.1.1 Variatie van Cd-gehalte in het aquariumwater en het voedsel ……………………… 27

3.1.2 Cd-accumulatie in de verschillende weefsels ……………………………………….. 28

3.1.3 Cd-accumulatie na 28 dagen ………………………………………………………… 32

3.2 Metaalaccumulatie in veld …………………………………………………………………… 32

3.2.1 Metaalconcentraties in het water voor de vier studieplaatsen ………………………. 32

3.2.2 Metaalaccumulatie in de verschillende weefsels ……………………………………. 32

3.2.3 Cd-accumulatie na 28 dagen ……………………………………………………... 37

3.3 Accumulatie van PCB’s & pesticiden ……………………………………………………….. 37

3.4 Effecten op weefselniveau …………………………………………………………………… 39

3.4.1 Ionenconcentraties en osmolariteit ………………………………………………….. 39

3.4.2 Acetylcholinesterase-activitiet ………………………………………………………. 42

3.4.3 MT’s …………………………………………………………………………………. 44

3.4.3.1 MT-gehalte per staalnameplaats i.f.v. de tijd ………………………………… 44

3.4.3.2 Metallothioneïnen i.f.v. de afzonderlijke metalen ……………………………. 45

3.5 Effecten op organismaal niveau ……………………………………………………………… 47

3.5.1 Groei, hematocrietwaarde, HSI & conditiefactor i.f.v. cadmiumgehalte in de lever . 47

4 Bespreking resultaten ………………………………………………………………………………. 49

4.1 Cd-accumulatie in labo ………………………………………………………………………. 49

4.2 Metaalaccumulatie in veld …………………………………………………………………… 51

4.3 Accumulatie van PCB’s & pesticiden ……………………………………………………….. 52

4.4 Effecten op weefselniveau …………………………………………………………………... 53

4.4.1 Osmolariteit en ionenconcentraties ………………………………………………….. 53

4.4.2 Acetylcholinesterase-activitiet ………………………………………………………. 53

4.4.3 MT’s …………………………………………………………………………………. 54

4.5 Effecten op organismaal niveau ……………………………………………………………… 55

4.5.1 Groei, hematocrietwaarde, HSI & conditiefactor i.f.v. cadmiumgehalte in de lever.. 55

5 Besluit ………………………………………………………………………………………………. 57

Referenties

Bijlage I: figuren

Bijlage II: lijst met gebruikte producten

Bijlage III: figuren



Bijlage VI: tabellen


Gebruikte afkortingen en hun betekenis
ACh Acetylcholine

AChE Acetylcholinesterase

As Arseen

BCR 185 Community bureau of reference material

Ca Calcium

Cd Cadmium

Cl Chloor

Cr Chroom

Cu Koper

DDE (1,1–dichloor -2,2-bis(p-chloorfenyl)etheen)

DDT Dichloordifenyl-trichloorethaan

GC-ECD Gas Chromatography Electron Capture Detection

GF-AAS Grafietoven Atomaire Absorbtie Spectrometrie

H20 dest. Gedestilleerd water

HCB Hexachloorbenzeen

ICP-AES Inductively Coupled Plasma – Atomic Emissions Spectrometry

K Kalium

KS Kooi met vissen die blootgesteld is aan het sediment en het water

KW Kooi met vissen die blootgesteld is aan het water

MFO Mixed function oxidase

MS 222 Ethyl 3-aminobenzoaat methylsulfon

MT Metallothioneïne

Na Natrium

Ni Nikkel

OCP Organochloorpesticiden

Pb Lood

PCB Polychloorbifenylen

Rbcn Rode bloedcellen

SW Standaard water

VMK 102 Mussel tissue reference material

V 1 Vissen die blootgesteld werden aan gecontamineerd voedsel van

1 µM Cd

V 2,5 Vissen die blootgesteld werden aan gecontamineerd voedsel van

2.5 µM Cd
W 1 Vissen die blootgesteld werden aan gecontamineerd water van

1 µM Cd

W 2.5 Vissen die blootgesteld werden aan gecontamineerd water van 2.5 µM Cd

Zn Zink

Samenvatting
In dit onderzoek werden karpers (Cyprinus carpio) onder labo- en veldomstandigheden blootgesteld aan zware metalen en werd nagegaan of er een verband gevonden kon worden tussen geaccumuleerde gehalten in de organen en effecten.
In een labo-experiment werden karpers in aquaria zowel via het voedsel als het water blootgesteld aan verschillende Cd-concentraties. Op vaste tijdstippen werden voor beide blootstellingsmethoden de accumulatie aan Cd in een aantal organen van de blootgestelde vissen bepaald. Er werd nagegaan wat de accumulatievolgorde van Cd was in de verschillende organen. Voor de effecten op weefselniveau werd er gekeken naar veranderingen in acetylcholinesterase-activiteit (AChE-activiteit) in de hersenen. Voor de effecten op organismaal niveau werd er gekeken naar de hepatosomatische index (HSI), de conditiefactor, de groei en de hematocriet-waarde (hct-waarde). Ten slotte werd de bruikbaarheid van de effecten op weefsel- en organismaal niveau als eventuele biomerker onderzocht.

Uit het labo-experiment bleek dat de vissen die aan water van 2,5 µM Cd werden blootgesteld, de enige vissen waren die significant meer Cd in hun organen hadden geaccumuleerd dan de vissen van de andere aquaria. De accumulatievolgorde van Cd in de verschillende organen bleek niet te verschillen tussen de vissen die via het water werden blootgesteld en de vissen die via het voedsel werden blootgesteld. De volgorde was als volgt lever > darm > kieuw > restant. Enkel de HSI en de conditiefactor konden als biomerker gebruikt worden voor cadmiumcontaminatie van het water onder labo-omstandigheden.


In een veldexperiment werden karpers in kooien, zowel via het sediment als het water blootgesteld aan zware metalen en organische polluenten in een aantal oppervlaktewateren. Op vaste tijdstippen werd voor beide blootstellingsmethoden de accumulatie van zware metalen over een aantal organen onderzocht. Er werd ook gekeken of de accumulatie van een bepaald metaal in een orgaan gerelateerd kon worden aan de concentratie van dit metaal in het water. De hoeveelheden PCB’s en pesticiden, geaccumuleerd in het vetweefsel, werden eveneens op vaste tijdstippen bepaald. De bruikbaarheid van de kooi voor de blootstelling van vissen aan sediment en water werd ook nagegaan. Voor de effecten op weefselniveau werd er gekeken naar AChE-activiteit in de hersenen, metallothioneïne-inductie in de lever en osmolariteit van het bloed. Voor de effecten op organismaal niveau werd er gekeken naar de HSI, de conditiefactor, de groei en de hematocrietwaarde. Ten slotte werd de bruikbaarheid van de effecten op weefsel- en organismaal niveau als eventuele biomerker onderzocht.

Uit het veldexperiment bleken de karpers vooral metalen te accumuleren die in het studiegebied in hoge concentraties voorkwamen. De accumulatievolgorde van Cd in de verschillende organen verschilde niet tussen de vissen die aan het water werden blootgesteld en de vissen die ook aan het sediment werden blootgesteld. De volgorde was als volgt: kieuw > lever = darm.

In de studiegebieden vertoonden de vissen ook een duidelijke opname van organische polluenten in hun vetweefsel. Er werden echter geen significante verschillen aangetoond in de accumulatie van organische polluenten tussen vissen die via het water werden blootgesteld en vissen die ook via het sediment werden blootgesteld.

De kooi bleek niet geschikt om vissen bloot te stellen aan het sediment. De kooi bleek wel geschikt voor een blootstelling aan het water van stilstaande wateren. Dit echter voor een korte blootstellingsperiode omdat de vissen zich in de kooien onvoldoende of niet konden voeden.

De osmolariteit, acetylcholinesterase-activiteit, conditiefactor en metallothioneïne-inductie konden gebruikt worden als biomerkers voor metaalverontreiniging onder veldomstandig-heden. Ook het gebruik van acetylcholinesterase-activiteit als biomerker voor een pollutie van hexachloorbenzeen werd in deze veldstudie aangetoond.

1 Inleiding

1.1 Probleemstelling

Zware metalen zijn anorganische polluenten waarvan de meeste van nature uit aanwezig zijn in vrijwel alle bodems, in gehaltes afhankelijk van de mineralogische samenstelling en van de optredende verweringsprocessen (Nouwen et al., 2001). Antropogene verspreiding van zware metalen in het aquatisch milieu gebeurt vooral via lozing van huishoudelijk afvalwater, afvloeiing van regenwater en lozing van industrieel afvalwater (Connell et al, 1999a).

In heel wat bedrijfstakken en producten worden zware metalen gebruikt zoals:
koper: elektriciteitsdraden, woningbouw (regenpijpen), kunstmest en dierlijke mest, juwelen, muntstukken, gereedschap, sieraden, beeldhouwwerken, zouten van koper worden gebruikt als pesticiden.
zink: anticorrosiemiddelen, batterijen, dakbedekking, verbranding van huishoudelijk afval, muntstukken, verfstoffen, rubberen producten, cosmetica, farmaceutica, vloerbedekking, plastics, printinkt, zeep en textielen.
lood: batterijen, loodhoudende benzine, loodgieterij.
nikkel: verbranding van residuele (zware) stookolie, behandeling van metaaloppervlakken, scheepsbouw, de auto- en vliegtuigindustrie, galvanisatie, vernis voor keramiek, batterijen en juwelen.
cadmium: mijnbouw, bosbouw , brandstoffen, fosfaatindustrie, ertsverwerkingsindustrie, batterijen, fungicide, pigmenten, stabiliseringsmiddel voor plastics, beschermkap voor nucleaire reactoren en fosforiscerende stoffen in zwart-wit en kleurenbeeldbuis van televisies.
chroom: verharden en roestvrij maken van staal, verfindustrie, leerlooierij.
kobalt: batterijen, magnetische folie, anticorrosiemiddel.
(Provinciaal Centrum voor Milieuonderzoek, 2002; Wright & Welbourn, 2002c).

Omwille van de toenemende bezorgdheid voor het milieu zijn er een aantal waterkwaliteitsnormen opgesteld om de oppervlaktewaterkwaliteit te beschermen. Dit zijn normen voor individuele componenten waarvan de concentratie in de waterloop niet mag worden overschreden. Deze normen zijn gebaseerd op resultaten uit toxiciteitstesten waarin proeforganismen worden blootgesteld aan een concentratiereeks van de stof in kwestie. Hierbij wordt er gekeken naar die concentratie die een bepaalde respons (meestal mortaliteit) teweegbrengt (Connel et al., 1999b). De resulterende waarde wordt dan gedeeld door een arbitrair gekozen veiligheidsfactor om zo een veilig niveau te verkrijgen.

De bepaling van een waterkwaliteitsnorm uit een toxiciteitstest is sterk afhankelijk van de testsoort (Dobbs et al., 1994) en het is evident dat waterkwaliteitsdoelstellingen niet alleen voor enkelvoudige stoffen bepaald moeten worden, maar ook voor mengsels van verschillende stoffen (Vighi M. et al., 2003).

Enkele basismilieuwaterkwaliteitsnormen en achtergrondwaarden in niet-verontreinigde oppervlaktewateren voor zware metalen worden weergegeven in tabel 1.


Tabel 1: basismilieuwaterkwaliteitsnormen en achtergrondwaarden in niet-verontreinigde opper-vlaktewateren voor zware metalen (Vlaamse Overheid, 2000; Bervoets & Blust, 2003)

Zwaar metaal

achtergrondwaarde

( in g/l )

norm

( in g/l )

Cd

< 0.2

1.0

Cr

0.2 ± 0.3

50

Cu

3.5 ± 1.3

50

Ni

2.7 ± 1.9

30

Pb

0.3 ± 0.14

50

Zn

86 ± 41

200

Bij toxiciteitstesten gebaseerd op zware metalen waaruit de waterkwaliteitsnormen afgeleid zullen worden, worden de in het water opgeloste metalen meestal als de enige belangrijke vorm van metalen beschouwd die bijdraagt tot toxiciteitsverschijnselen bij vissen. Metalen verdelen zich echter over verschillende compartimenten van het ecosysteem en het voedsel vormt bij vele bentische vissoorten ook een belangrijke bron van metaalaccumulatie (Kraal et al., 1995). Metaalopname via het voedsel treedt hoofdzakelijk op in laag gecontamineerde wateren (Segner & Back, 1985).

Een derde mogelijke blootstellingsroute is het sediment (Allen-Gill et al., 1997). In het algemeen vormt het sediment de grootste opslagplaats voor chemicaliën in het aquatisch milieu (Adams et al., 1992). In het sediment kunnen zware metalen soms jarenlang accumuleren. Als lozingen van zware metalen gestopt worden, zal de waterbodem vaak sterk vervuild blijven. De waterbodem treedt op als een bron van verontreiniging voor het bovenliggende water via naleveringsprocessen zoals resuspensie, convectie en diffusie (Fedinger & Adams, 1987).

Afhankelijk van de levenswijze van een organisme, zal het in meerdere of mindere mate blootgesteld worden aan metalen uit de verschillende compartimenten. De accumulatie van metalen is echter sterk afhankelijk van fysico-chemische en biologische factoren (Hakanson, 1984). Deze factoren zijn er mede de oorzaak van dat de opstapeling van de metalen sterk kan verschillen van plaats tot plaats. Ook het aandeel van de contaminatie in de verschillende compartimenten speelt een belangrijke rol.

De metaaltoxiciteit, veroorzaakt door opname via voedsel of sediment, werd tot nu toe grotendeels verwaarloosd of er wordt weinig belang aan gehecht. Pas de laatste jaren is het aantal studies dat opname via voedsel bij vissen bestudeert, toegenomen (Szebedinsky et al., 2001; Kamunde et al., 2001).
Doordat er weinig belang wordt gehecht aan de verschillende blootstellingsroutes en bovendien weinig rekening wordt gehouden met het effect van omgevingsomstandigheden op de opname en accumulatie van zware metalen, zijn de experimentele resultaten uit de blootstellingstesten vaak verschillend van de reële situatie in de natuurlijke omgeving. Voor de wetgeving is het bijgevolg moeilijk om veilige normen op te stellen voor metaalgehaltes in veldsituaties, omdat de metaalopname bij vissen afhangt van vele factoren.

Er blijft een discussie over het relatieve belang van de verschillende opnameroutes bij de accumulatie van zware metalen in vissen (Kraal et al., 1995).


1.2 Zware metalen en hun effecten

Zware metalen zijn natuurlijke bestanddelen van het milieu (Connell et al, 1999a). Ze worden getypeerd als die metalen met een dichtheid van meer dan 5 g/cm3 (Van Assche, 2000). Sommige zware metalen kunnen ook voorkomen in de oxyanionvorm (bv. AsO43-) (Ochiai, 1995).

De 8 zware metalen die door de Derde Noordzeeconferentie als prioritair worden beschouwd, worden weergegeven in tabel 2.
Tabel 2: De 8 zware metalen die door de Derde Noordzeeconferentie als prioritair worden beschouwd (Nouwen et al., 2001)


metaal

Dichtheid

(in g/cm3)

Arseen (As)

5,73

Cadmium (Cd)

8,64

Chroom (Cr)

7,20

Kwik (Hg)

13.6

Lood (Pb)

11,3

Koper (Cu)

8.92

Nikkel (Ni)

8,90

Zink (Zn)

7.14

Sommige zware metalen hebben essentiële biologische functies. Voorbeelden van essentiële zware metalen zijn Cu, Zn en Fe die vitale componenten vormen voor enzymen, respiratorische proteïnen en enkele structurele elementen (Depledge et al., 1994). Essentiële metalen zijn noodzakelijk aanwezig om een normale ontwikkeling en functioneren van het organisme te verzekeren. De gehalten aan essentiële metalen moeten dan wel binnen bepaalde concentratiegrenzen gereguleerd worden. Als de concentratie aan essentiële metalen in het organisme onder een bepaald kritisch niveau daalt, dan zal dit een negatieve impact veroorzaken op het organisme. Hoe groter het tekort aan essentiële metalen, hoe sterker de negatieve invloed op het organisme. Indien de biobeschikbare concentratie aan essentiële metalen in het milieu boven een kritisch niveau stijgt, is regulatie niet meer mogelijk en stapelen de metalen zich op in het organisme (accumulatie). Deze overmatig aanwezige essentiële metalen zullen dan toxisch worden en dit toxisch effect zal versterken naarmate de concentratie verhoogt (Connell et al., 1999a).

Andere zware metalen hebben geen gekende biologische functie en worden niet gereguleerd door het organisme. Voorbeelden van zulke niet-essentiële metalen zijn Cd, Hg en Pb welke reeds bij zeer lage blootstellingsconcentraties toxisch kunnen zijn (Rainbow, 1985).
Zware metalen kunnen in het lichaam van de vis opgenomen worden via 3 belangrijke routes. Een eerste route is via het voedsel. In dit geval moeten de zware metalen de epitheelcelmembranen van de darm passeren. Een tweede route is via het respiratorische weefsel van de kieuwen en een derde route is rechtstreeks via het lichaamsoppervlak (Connell et al., 1999c). Afhankelijk van het metaal en een aantal omgevingsomstandigheden, zullen vissen zware metalen op een actieve of passieve wijze opnemen (Wright et al., 2002a). Meestal zijn het de zware metalen in de vrije ionvorm die door passieve diffusie opgenomen kunnen worden langsheen het lichaamsoppervlak of de kieuwen. Het transport van vrije ionen langsheen de celmembraan kan ook vergemakkelijkt worden door binding aan liganden in de celmembraan. Cd is een voorbeeld van een zwaar metaal dat op een actieve wijze via calciumionenpompen opgenomen wordt (Depledge et al., 1994). Na het passeren van het celmembraan kunnen de zware metalen getransporteerd worden naar verschillende organen, via het bloed, lymfe of hemolymfe. Afhankelijk van hun chemische eigenschappen en het soort weefsel of orgaan, zullen sommige zware metalen een grotere affiniteit vertonen voor bepaalde weefsels of “doelwitorganen”. Zo heeft Cd de neiging om zich te concentreren in de nieren en de beenderen, terwijl Pb zich concentreert in hersenweefsel en beenderen (Connell et al., 1999c).
De biobeschikbaarheid van metalen hangt af van de chemische speciatie van het metaalion, de chemische samenstelling van het water en de aanwezigheid van organische componenten en gesuspendeerde partikels (Van Ginneken, 1998). De chemische samenstelling van het water wordt bepaald door fysico-chemische factoren zoals de temperatuur, de pH, de hardheid, de oxygenatie en de saliniteit (Mayer et al., 1994).

Een temperatuursverandering kan een wijziging in het ectotherm metabolisme teweegbrengen. Het ectotherm metabolisme verdubbelt ongeveer bij elke verandering van 10°C. Veranderingen in het metabolisme uiten zich door een verandering in ademhalingssnelheid, chemische absorptie, detoxificatie en excretiesnelheden.

Hoe lager de pH van het water, of m.a.w. hoe hoger de concentratie aan H+-ionen, hoe meer metaalionen worden vrijgesteld uit het sediment. Dit is te verklaren doordat de H+-ionen de metaalionen in metaalverbindingen vervangen, waardoor de vrije metaalionen vrijkomen. Deze vrije metalen kunnen opgenomen worden door het organisme, maar de H+-ionen zullen ook in competitie treden met de vrije metaalionen, waardoor minder vrije metalen opgenomen worden (Mayer et al., 1994).

In het algemeen zal de toxiciteit van metalen reduceren bij een verhoogde hardheid van het water. Dit is te verklaren doordat Ca2+- ionen, die veel aanwezig zijn in water met een hoge hardheid, het kieuwepitheel minder permeabel maken voor vrije metaalionen. Bovendien treden de Ca2+- ionen ook in competitie met de vrije metalen (Mayer et al., 1994).

Bij lage O2-gehaltes in water bevinden de meeste moleculen zich in een gereduceerde toestand. Deze gereduceerde moleculen (bvb. NH4 & H2S) kunnen gemakkelijk binden met vrije metaalionen, waardoor de metalen neerslaan en bijgevolg minder biobeschikbaar zijn. Bij hogere O2-gehalten in het water bevinden de meeste moleculen zich in een geoxideerde toestand (bvb. NO3 & SO4) die niet binden met vrije metaalionen (Mayer et al., 1994).

De aanwezigheid van organische componenten en gesuspendeerde partikels kan de activiteit van vrije metaalionen wijzigen. Metalen kunnen oplosbare complexen vormen met componenten van eenvoudige liganden zoals Cl--, OH-- en aminozuren tot colloïdes en grote complexen zoals kleien, humusachtige deeltjes en polysacchariden (Wright et al., 2002d).

De binding aan en vrijstelling van metalen van het sediment spelen een rol in hun biobeschikbaarheid (Dallinger et al., 1987). Ook biologische of chemische transformaties zoals bvb. de methylatie van kwik, beïnvloeden eveneens de biobeschikbaarheid van metalen (Dallinger et al., 1987).

Ook een aantal biologische factoren zoals soortverschillen in voedingsgedrag en habitatvoorkeur spelen een rol in de biobeschikbaarheid van metalen (Dallinger et al., 1987).

Vissen beschikken over een aantal defensiemechanismen tegen metalen:

- Algemene tolerantie

De meeste zware metalen worden tot een bepaalde maat getolereerd door vissen. De tolerantiegraad is sterk afhankelijk van de vissoort zelf, zijn levensfase en het soort zware metaal. Zware metalen moeten getransporteerd worden naar plaatsen, waar ze hun toxische effecten niet kunnen uitoefenen. Zulke plaatsen kunnen celwanden zijn, bepaalde delen van het celmembraan, lysosomen, beenweefsel en huid (Ochiai, 1995).

Sommige vissen blijken zich binnen een populatie beter te kunnen aanpassen dan andere en verkeren bijgevolg in een betere conditie. Dit leidt tot selectie van bepaalde kenmerken zodat de volgende generaties beter aangepast zijn aan nieuwe omstandigheden (adaptatie). Deze adaptatie kan er voor zorgen dat aquatische invertebraten of vissen, afkomstig uit historisch verontreinigde oppervlaktewaters, minder effect ondervinden van de novo metaalveront-reiniging dan dezelfde soorten die leven in niet-verontreinigde oppervlaktewaters (Lin H.C. et al., 2000).

- Secretie van mucus

Mucus dat door vissen geproduceerd wordt, bestaat uit anione polysacchariden. Deze bevatten carboxylaat- en/of sulfaatgroepen die kationen (zware metalen) kunnen binden, waardoor ze niet meer beschikbaar zijn (Ochiai, 1995).


- Metallothioneïnen

Metallothioneïnen (MT’s) zijn metaalbindende proteïnen met een aantal typische biochemische eigenschappen; ze hebben een laag moleculair gewicht (6000-8000 Da, 60-62 aminozuren), ze hebben een hoge warmtestabiliteit en een hoog cysteïnegehalte (30%) (Kägi & Kojima, 1987; Kägi & Shaffer, 1988).

MT’s hebben een hoge affiniteit en bindingscapaciteit voor zware metalen (7-9 g atomen mol-1 thioneïne). Deze affiniteit verschilt van metaal tot metaal (Hg2+ > Cu+ > Cd2+ > Zn2+) (Viarengo, 1989). MT’s kunnen zowel essentiële als niet-essentiële metalen binden in tetrathiolaatclusters (Viarengo et al., 1999). Deze metallotetrathiolaatclusters voorzien het proteïne van een zeer stabiele tertiaire structuur, wat hun hoge warmtestabiliteit verklaart (Kägi & Kojima, 1987).

De hoofdfunctie van MT’s is de homeostase van essentiële metalen zoals Zn en Cu (Bremner & Beattie, 1990). Ze zouden echter ook een belangrijke rol spelen in de detoxificatie van zware metalen door het wegvangen van overvloedige metalen (Cosson et al., 1991). Het is bewezen dat MT’s geïnduceerd worden wanneer vissen via het voedsel of het water aan verhoogde metaalgehalten worden blootgesteld (Olsson & Hogstrand, 1987; De Smet H., 2001). De geïnduceerde MT’s zullen metalen binden en immobiliseren, waardoor hun intracellulaire effecten tegen worden gegaan. Metalen die aan MT’s gebonden zijn, zullen enkel vervangen worden door metalen met een hogere bindingsaffiniteit (Kägi, 1993).

MT-inductie in vissen kan beschouwd worden als een biochemische biomerker van blootstelling aan metalen. Ze kunnen m.a.w. gebruikt worden als signaal voor een blootstelling aan metalen in het veld (Olsvik et al., 2001; Van Campenhout et al., 2003). Een ecotoxicologische biomerker kan gedefinieerd worden als een xenobiotisch-geïnduceerde wijziging in biochemische of cellulaire componenten, processen, structuren of functies die meetbaar zijn in een biologisch systeem of staal (Depledge, 1994).
Indien de defensiemechanismen van het organisme falen of niet bestand zijn tegen een overmaat aan zware metalen, dan zullen de toxische effecten van zware metalen optreden.

De toxiciteit van zware metalen kan veroorzaakt worden door de volgende biochemische en moleculaire wijzigingen (Ochiai, 1995):

-Blokkeren van de essentiële functionele groepen van biomoleculen zoals enzymen.

-Verdringing van essentiële metaalionen van biomoleculen, waardoor deze meestal hun activiteit verliezen.

-Wijziging van de actieve biomoleculeconformatie van voornamelijk enzymes.

-Verstoring van de integriteit van biomembranen.

-Binding met bio-anionen waardoor het gehalte aan essentiële bio-anionen (vb. PO43-) daalt.

Zware metalen kunnen de normale fysiologische functies van de vis aantasten, wanneer de biochemische en moleculaire wijzigingen een bepaald niveau bereiken. Zo kan de energie die beschikbaar is voor de groei sterk gereduceerd worden, wanneer een vis onder stress staat van zware metalen (Connell et al., 1999c). Ook een daling van de hematocrietwaarde en hepatosomatische index (=gewicht lever/totale lichaamsmassa  100) ten gevolge van zware metalen is aangetoond (Larsson et al., 1976).


Zoetwatervissen zijn osmoregulatoren, die op een actieve wijze een interne osmolariteit behouden die hoger is dan de osmolariteit van hun omgeving (het zoete water). Deze hyperosmolariteit ten opzichte van hun omgeving, kunnen ze enkel behouden door het tegengaan van een netto-wateropname en een netto-zoutverlies. De twee meest voorkomende elektrolyten in het bloedplasma van vissen zijn Na+ en Cl-.

De kieuwen fungeren als de belangrijkste osmoregulatorische organen bij de vissen. De kieuwen bestaan uit plaveiselcellen en chloridecellen. De plaveiselcellen bezitten een proton ATP-ase en Na+-kanalen in het apicale membraan. Het proton ATP-ase pompt protonen uit de kieuwen, waardoor er een potentiaal ontstaat die Na+ in de cel dwingt. In het basolaterale membraan bevinden er zich K+-kanalen en een Na+/K+ ATP-ase die de Na+- en de K+-concentraties reguleren in het bloed (Eckert, 1997).

De chloridecellen van het kieuwepitheel staan in voor de opname van Cl- en Na+ uit het water. Aan de apicale zijde van de cellen vindt een uitwisseling van Na+ tegen H+ en Cl- tegen HCO3- plaats. Aan de basolaterale zijde bevinden zich Cl--kanalen en Na+/K+ATP-asen die de Na+- en de K+-concentraties reguleren in het bloed (Zandee et al., 1986).

Uit experimenten is gebleken dat bij vissen, die blootgesteld werden aan Pb, het K+- gehalte in bloedplasma niet veranderde, maar dat de gehalten van de twee meest voorkomende elektrolyten (Na+ en Cl-) daalden. De daling van het Na+ en Cl--gehalte resulteerde in een lagere osmolariteit van het bloedplasma (Rogers et al., 2003).

1.3 PCB’s & pesticiden

Polychloorbifenylen (PCB’s) en pesticiden zijn persistente, toxische organochloorver-bindingen, die door hun vetoplosbare eigenschap opgenomen kunnen worden door mens en dier. Ten gevolge van deze opstapeling zijn de gehaltes van organische polluenten hoger in dieren bovenaan de voedselketen (Vandecasteele et al., 2001).


Polychloorbifenylen (PCB’s) zijn kleine vlakke moleculen, opgebouwd uit twee bezeen(fenyl)ringen die aan elkaar verbonden zijn via een koolstof-koolstof-binding. Aan deze bifenylkern kunnen chlooratomen gesubstitueerd zijn aan de tien beschikbare koolstoffen van de molecule. (Wright et al., 2002b). Er bestaan 209 mogelijke PCB-congeneren. Dit is te verklaren door het aantal gebonden chlooratomen en hun substitutiepatroon in de ortho, ortho’, meta, meta’, para en para’ posities op de bifenylkern (in fig. 1 van bijlage I wordt een vb. van een pcb-congeneer gegeven). Elke congeneer wordt vaak geïdentificeerd met een getal van 1 tot 209 (Niimi A.J., 1994).
De commerciële productie van PCB’s startte circa 70 jaar geleden. PCB’s worden gebruikt in gesloten en open toepassingen. Gesloten toepassingen zijn transformatoren, condensatoren en andere elektrische componenten. Voorbeelden van open toepassingen zijn onder meer inkt, verf, olie voor vacuümpompen en pesticidedragers. PCB’s kunnen in het milieu terechtkomen door verdamping, door lekken in PCB-houdende apparaten of door verbranding van materialen die PCB’s bevatten. Ook de verbranding van afvalstoffen, andere verbrandingsprocessen (bv. verkeer en gebouwenverwarming), chemische en metallurgische processen zetten PCB’s vrij in het milieu (Vandecasteele et al., 2001).
Pesticiden of bestrijdingsmiddelen worden in de landbouw, door de bevolking, in industriële processen, in de sector handel en diensten en verkeer en vervoer gebruikt ter bestrijding van allerlei ongewenste aantastingen van gewassen, goederen en materialen. Hierbij kunnen ze nadelige effecten hebben voor het milieu door hun toxische invloed op niet-doelorganismen.

Hoewel bestrijdingsmiddelen meestal vrij lokaal gebruikt worden, kunnen zowel op korte als op lange afstand van het toepassingsgebied nog aanzienlijke residu’s vastgesteld worden door driftverschijnselen, door evaporatie van de behandelde oppervlakten en door depositie via regen en stof. De persistentie van bestrijdingsmiddelen in het milieu varieert van enkele dagen tot meerder jaren (Steurbaut et al., 2001).

De pesticiden die in de landbouw gebruikt worden, zijn herbiciden, insecticiden en fungiciden. De meeste synthetische insecticiden die sinds Wereldoorlog II gebruikt worden, zijn de organochloriden, organofosfaten, carbamaten en de pyrethroiden.

De best gekende organochloorpesticide is DDT (dichloordifenyl-trichloorethaan). DDT is een kleine vlakke molecule die door enzymen van MFO-systeem gemetaboliseerd kan worden tot DDE (1,1 – dichloor-2,2-bis(p-chloorfenyl)etheen) (zie fig. 2 van bijlage I).

Een ander voorbeeld van een organochloorpesticide is hexachloorbenzeen (HCB) (Wright et al., 2002b). (zie fig. 3 van bijlage I)
Eén van de basisstrategieën van organismen voor de detoxificatie van organische polluenten, bestaat uit een snelle verwijdering uit het lichaam om de blootstelling te minimaliseren. In vertebraten moeten chemische stoffen eerst opgelost worden in urine of zweet vooraleer ze geëxcreteerd kunnen worden. Om toxicanten oplosbaar te maken, zullen ze eerst omgezet worden in meer polaire en hydrofiele vormen. Deze transformatie gebeurt in de meeste organismen door 2 opeenvolgende fases: de fase I - en de fase II transformatie. In de fase I transformatie zal er een polaire groep aan de toxicantmolecule toegevoegd worden. Het enzymesysteem dat verantwoordelijk is voor de fase I transformatie is gekend als het mixed function oxidase (MFO) systeem.

De resulterende meer polaire molecule zal vervolgens in de fase II transformatie covalent gebonden worden aan verschillende endogene metabolieten (bv. suikers, peptiden en sulfaten). Hierdoor is de toxicantmolecule omgezet in een meer polaire en hydrofiele vorm die gemakkelijker kan worden geëxcreteerd (Connell et al., 1999c).


Ook voor organische polluenten zijn er waterkwaliteitsnormen opgesteld. In tabel 3 worden waterkwaliteitsnormen voor enkele organische polluenten weergegeven (Vlaamse Overheid, 2000).
Tabel 3: waterkwaliteitsnormen voor enkele organische polluenten (Vlaamse Overheid, 2000)

organische polluent

norm

( in g/l )

 PCB’s

 0,007

 HCB

 0,01

 pp-DDE

 10

De grootte en de vorm van organische moleculen en eigenschappen zoals het aantal chlooratomen zullen het transport, de bio-accumulatie en de toxiciteit op een complexe manier beïnvloeden. Het aantal chlooratomen die aan de organische moleculen gebonden zijn, zal de persistentie van de organische molecule vergroten. De apolaire en hydrofobe eigenschappen van organische moleculen zorgen er voor dat ze zich kunnen associëren met organische partikels in het aquatisch milieu. Deze binding speelt een belangrijke rol in hun biobeschikbaarheid (Wright et al., 2002b). Dankzij hun lipofiel karakter kunnen de organische polluenten na hun opname, accumuleren in het vetweefsel (Connell et al., 1999c). Over het algemeen kunnen kleine vlakke organische moleculen met drie of minder benzeenringen, zoals DDT en PCB’s, een acute toxiciteit uitoefenen. Deze acute toxiciteit wordt veroorzaakt door hun capaciteit om zich te associëren met membranen waardoor ze de integriteit verstoren (Wright et al., 2002b).

Organofosfaten en carbamaten kunnen een neurotoxische invloed uitoefenen door een inhibitie van het enzyme acetylcholinesterase (AChE) (Fisher et al., 2000).

Acetylcholine (ACh) is de belangrijkste neurotransmitter tussen neuronen. ACh wordt door een presynaptisch neuron gelost in de synaps om vervolgens te binden met ACh-receptoren van een post-synaptisch neuron. Deze binding initieert een elektrische impuls waardoor de “boodschap” wordt overgebracht. Om een continue stimulatie van de postsynaptische cel te vermijden, moeten de resterende ACh-moleculen verwijderd of afgebroken worden. Het enzyme AChE staat in voor de afbraak van ACh door deze molecule te hydrolyseren tot acetaat en choline (Lodish et al., 2000).

De inhibitie van AChE-activiteit wijst op een blootstelling aan acetylcholinesterase-inhiberende pesticiden, zoals organofosfaten en carbamaten. Bijgevolg kan de AChE-activiteit gebruikt worden als een biomerker voor de detectie van pesticidevergiftiging in mensen en dieren (Fisher et al., 2000). Recent is ook aangetoond dat AChE-activiteit gebruikt kan worden als biomerker voor blootstelling aan zware metalen, omdat hoge lichaamsconcentraties aan zware metalen in het lichaam van een organisme overeenkwamen met een daling in de AChE-activiteit (de la Torre et al., 2002).

1.4 Doelstellingen

De hoofddoelstelling van deze thesis was om na te gaan of het mogelijk is om relaties te vinden tussen geaccumuleerde gehalten aan zware metalen in visweefsels en effecten. Hierbij werd er gekeken of de effecten verschilden naargelang de blootstellingsroute. Om de doelstelling te bereiken werd zowel een laboratotium- als een veldstudie uitgevoerd.
In een labo-experiment werden de verschillen in accumulatie en effecten van cadmium nagegaan tussen karpers die in aquaria blootgesteld werden aan cadmium-gecontamineerd voedsel en karpers die in aquaria blootgesteld werden aan cadmium-gecontamineerd water. Er werd nagegaan of de accumulatievolgorde van cadmium in de verschillende organen verschilt naargelang de blootstellingsroute. Er werd ook gekeken of de hoeveelheden geaccumuleerd metaal in de visorganen overeenkwamen met de metaalconcentraties in het water of het voedsel. Voor de effecten van cadmium werd er gekeken naar de effecten op weefselniveau (acetylcholinesterase-activiteit in het hersenweefsel) en de effecten op organismaal niveau (groei, hematocrietwaarde, hepatosomatische index en conditiefactor). Tevens werd er onderzocht welke effecten gerelateerd kunnen worden aan metaalgehalten in bepaalde organen, waardoor ze als biomerker gebruikt kunnen worden voor metaalvervuiling.
In een veldexperiment werden karpers via kooien blootgesteld enerzijds uitsluitend aan water en anderzijds aan water en sediment van een aantal gecontamineerde oppervlaktewateren. Ook in dit experiment werden de verschillen in accumulatie en effecten nagegaan tussen de twee blootstellingsgroepen. Bovendien werd ook de accumulatie en effecten van organische polluenten bepaald. Voor de accumulatie van cadmium werd de accumulatievolgorde van het zwaar metaal in de verschillende organen onderzocht. Er werd ook gekeken of de hoeveelheden geaccumuleerd metaal in de visorganen overeenkwamen met de metaalconcentraties in het oppervlaktewater. Voor de effecten van cadmium werd er gekeken naar de effecten op weefselniveau (osmolariteit in bloedplasma, acetylcholinesterase-activiteit in het hersenweefsel en inductie van metallothioneïnen) en de effecten op organismaal niveau (groei, hematocrietwaarde, hepatosomatische index en conditiefactor). Tevens werd er onderzocht welke effecten gerelateerd kunnen worden aan metaalgehalten in bepaalde organen, waardoor ze als biomerker gebruikt kunnen worden voor metaalvervuiling. Voor de accumulatie van organische polluenten werd ook het verschil in accumulatie bepaald tussen vissen die via het sediment en het water werden blootgesteld. Voor de effecten van organische polluenten werd er gekeken naar hun effect op de acetylcholinesterase-activiteit in het hersenweefsel.

Bovendien werd ook de bruikbaarheid van gekooide karpers nagegaan voor monitoring van metaalverontreiniging in natuurlijke systemen.

2 Materiaal en methoden

2.1 Testorganisme

In het onderzoek werd gebruik gemaakt van gekweekte karpers (Cyprinus carpio) (zie fig. 1 van bijlage II).

De karper kent een weide verspreiding over Europa en komt in Vlaanderen talrijk voor in stilstaand water en traagstromende waterlopen. De karper staat relatief hoog in de voedselketen, zodat ook biomagnificatie onderzocht kan worden. De jonge dieren eten aanvankelijk plankton; later schakelen ze over op insectenlarven, slakken, wormen en plantaardig materiaal. De karper is een benthische soort die in de bodem woelt om zijn voedsel te vinden. De vrouwtjes leggen zo’n 93.000 tot 1.664.000 eitjes (Bãnãrescu & Coad, 1991). De paaitijd valt in juni-juli. De karper biedt tal van voordelen als testsoort. Hij is commercieel gemakkelijk verkrijgbaar en gemakkelijk te houden in aquaria. Hij heeft een relatief hoge tolerantie voor waterverontreiniging zodat deze vis aangetroffen kan worden in waters langsheen een gradiënt van metaalverontreiniging. Bovendien wordt hij algemeen aanvaard als testorganisme door de Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling (OESO) en de Europese Unie. De karpers die in dit onderzoek werden gebruikt, waren afkomstig van de Landbouwkundige Universiteit te Wageningen (Nederland), waar ze onder gecontroleerde omstandigheden werden gekweekt. De karpers die voor het labo-experiment gebruikt werden, hadden een gemiddelde lichaamslengte van 4 cm. De vissen die voor het veldexperiment gebruikt werden, hadden een gemiddelde lichaamslengte van 10 cm.


Het ongecontamineerde en gecontamineerde voedsel dat de karpers gedurende het experiment kregen, bestond uit levende larven van de dansmug, (Chironomus riparius) (zie fig. 2 van bijlage II).

De larven van dansmuggen komen voor in en op het bodemslib van zoete en brakwaterecosystemen. In organisch verontreinigde waterlopen kunnen zeer hoge densiteiten worden aangetroffen. De levenscyclus van het genus Chironomus duurt onder ideale omstandigheden (20°C) ongeveer vier weken en verloopt als volgt: de vrouwtjesmug zal na paring eistrengen afzetten op waterplanten en na enkele dagen sluipen de larven uit. De muggenlarve doorloopt vier stadia alvorens te verpoppen. De adulte muggen paren vrijwel onmiddellijk na het uitvliegen en leven slechts enkele dagen.



Chironomus overwintert als larve in de waterbodem, waarna de wintergeneratie zal uitvliegen van eind april tot en met half juni. In de zomer kunnen alle levensstadia worden aangetroffen. Afhankelijk van de temperatuur, vliegen ze uit vanaf begin augustus tot half oktober (Grootelaar et al., 1991; Kerkum, 1993). De larven, gebruikt als gecontamineerd voedsel, waren afkomstig van een gecontroleerde kweek uit het KBIN (Dr. Goddeeris) en werden opgekweekt van eistreng tot instar 3-4 in een Cd-gecontamineerde oplossing. De levende ongecontamineerde larven die gebruikt werden om de vissen voldoende te voeden, waren afkomstig van een viswinkel.

2.2 Labo-experiment

2.2.1 Aquaria met muggenlarven

Er werden drie scenario’s in plastieken aquaria uitgevoerd voor de opkweek van de muggenlarven:




  1   2   3   4   5


De database wordt beschermd door het auteursrecht ©opleid.info 2017
stuur bericht

    Hoofdpagina