Escherichia coli



Dovnload 22.82 Kb.
Datum21.08.2016
Grootte22.82 Kb.


Summary

Urinary tract infections (UTIs) are common in human beings. UTIs include cystitis, pyelonephritis and asymptomatic bacteriuria. Although UTIs are frequently relatively benign, these are often recurrent and cause major discomfort to the patient. Some complications can be severe and even life-threatening. UTIs cause a huge cost to the healthcare system and are a heavy burden for the hospital and the physician.

Most known Escherichia. coli are commensal or cause intestinal diseases. However, some E. coli infect other organs, these are named extra-intestinal pathogenic E. coli (ExPEC). ExPEC causing UTIs are known as uropathogenic E. coli (UPEC). Most community-acquired UTIs are caused by UPEC. Although UPEC have been intensively studied, so far there are no vaccines or effective treatments, other than antibiotics, available to treat for UPEC infections. A detailed understanding of the molecular genetic basis of the virulence of UPEC may contribute to the development of more effective therapeutics and prophylactics.

Comparison of complete genome sequences and epidemiological investigations demonstrated that UPEC share more than 50% of their genes with commensal E. coli and other ExPEC and that the clinical isolates belong to various phylogenetic groups and serotypes.

Virulence factors are the ammunition of the bacterial pathogens to attach to the epithelial cells of the organs of the host, escape from the host defenses, invade the host tissues, survive in the host and/or cause disease. The molecular mechanism of pathogenesis and the regulation of the discovered virulence factors have been intensively investigated. However, the interaction of UPEC with their host is rather complex. UPEC with variety of virulence factors stimulate several responses of the host, including apoptosis, immune and inflammatory responses, endocytosis of UPEC and dispersal of the bacteria in intracellular bacterial communities (IBCs) in bladder epithelial cells.

During the present study, we first deciphered the molecular mechanism of the NAD dependence of UTI89, which is an acute cystitis isolate and of serotype O18:K1:H7. A mutation in the nadB gene, encoding L-aspartate oxidase, was shown to be responsible for the nicotinamide-requirement of UTI89. This was further confirmed by the complementation assay. Construction of site-specific point mutations, selection and analysis of spontaneous prototrophic revertants and sequencing of nadB of other NAD-dependent and independent O18 isolates demonstrated that the Ala28Val mutation in NadB completely impedes de novo synthesis of nicotinamide. However, no significant differences were observed between the virulence of isogenic NAD-auxotrophic and prototrophic strains in the murine ascending urinary tract infection model. We applied the nadB locus as a neutral site for DNA insertions in the bacterial chromosome, that is, we stably inserted other genes into the middle region of nadB to complement the genes inactivated on the chromosome. Such complementation is required to confirm the identification of these genes as virulence factors and is often difficult to perform using plasmids, as these are often lost at an excessive rate in vivo.

The use of the alkaline phosphatase gene phoA as a reporter in UTI89 is hampered by the presence of an indigenous phoA gene, causing a high background activity. Therefore, we decided to first construct a UTI89ΔphoA mutant. Since UTI89 is a refractory strain for using the Red recombination system, we first constructed the mutant in the E. coli K-12 strain BW25141. It turned out that the transducing phage P1 did not produced high titer lysates on BW25141ΔphoA::cat. Therefore we first transferred the ΔphoA::cat mutation to the wild type E. coli K-12 strain MG1655, and then to UTI89 via P1vir transduction, to produce the UTI89ΔphoA::cat mutant DV7728. At the same time, we observed that the phoA flanking sequences are almost identical between UTI89 and E. coli K-12. Therefore, we used longer flanking sequences to transfer the phoA deletion to UTI89, by Red-mediated recombination of a linear fragment that was amplified from DV7728 by PCR. The resulting UTI89ΔphoA mutant, DV7748, was used as a recipient strain for the construction of a transposon mutant library by conjugation with the donor strain S17-1 (λpir) harboring pGV4220, which contains a phoA reporter gene within the miniTn5phoA2 transposon.

We took advantage of the difference of nutrient requirements of DV7748 and S17-1(λpir) on minimal A medium to construct a transposon insertion mutant library. The transposon insertion mutants were selected on minimal A medium containing nicotinamide and kanamycin, and were then further tested on LB containing the PhoA substrate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (X-P). A set of 103 miniTn5phoA2 insertion mutants were analyzed and the insertions of 96 mutants were localized. In total, 91 discrete insertions were identified. The phenotype of these mutants was tested in vitro and in vivo. We found that the survival ratio of Caenorhabditis elegans feeding on mutant 26 with a disrupted wciP gene is statistically significantly higher than that of C. elegans feeding on the wild type strain. Further, screening for mutants defective in colonization in the bladder and kidneys of C3H/HeN mice, demonstrated tatA and pstC, nhaA as well as degP, yohJ and plasmid-encoded genes p060 and p135 potentially are virulence determinants of UTI89. Comparison of the data obtained in C. elegans and mice showed that several mutations affecting virulence in the mouse do not increase the lifespan of infected C. elegans and would not be identified if the screening is only performed in nematodes.

Using linear fragments amplified from the chromosome, the degP and yohJ transposon insertion mutations were transferred to wild type UTI89. Such construction of isogenic strains in a clean genetic background is required to prove the linkage between a mutant phenotype and an inactivated gene. The results demonstrated that the mucous colony morphology of the yohJ transposon insertion mutant resulted from some unlinked mutation but not from inactivation of yohJ. Comparison of the infection in the bladder and kidneys by degP mutants and the wild type strains in the murine UTI model, confirmed that degP plays an important role both in the cystitis isolate UTI89 and the pyelonephritis isolate CFT073. However, the contribution of degP to the colonization in the pyelonephritis isolate CFT073 is earlier than in the cystitis isolate UTI89.

Several mutations disrupted genes in the indigenous plasmid pUTI89. The plasmid-encoded protein ParB was shown to contribute to the virulence of UTI89. It is one of the proteins encoded by the parAB plasmid partitioning system. We isolated plasmid-free cells when only one of the genes, parB or parA, was replaced by a resistance marker. However, we could not isolate plasmid-free cells from the parAB mutant missing both genes. In addition, the plasmid pCP20, encoding the yeast FLP recombinase, cannot be harbored stably in the parB mutant, which implies some interaction between gene products in the UTI89 parB mutant and the plasmid pCP20.

In conclusion, the present study discovered the molecular mechanism of NAD dependence of O18 UPEC strains, developed a generalized method to transfer mutations between E. coli strains and disclosed a new neutral insertion site in the chromosome for complementation assays. Plasmid-free UTI89 derivatives were isolated by specific targeting of a plasmid partitioning gene, parB or parA. The plasmid partitioning gene parB was first confirmed as a virulence determinant of UPEC in the mouse model.

Samenvatting

Urineweginfecties zoals cystitis, pyelonefritis en asymptomatische bacteriurie, treden frequent op bij de mens. Hoewel urineweginfecties vaak relatief goedaardig zijn, kunnen deze herhaaldelijk optreden en groot ongemak veroorzaken voor de patiënt. Sommige complicaties kunnen echter ernstig en zelfs levensbedreigend zijn. Urineweginfecties veroorzaken ook grote kosten voor de gezondheidszorg en zijn een zware last voor het ziekenhuis en de arts.

De meeste Escherichia coli zijn commensaal of veroorzaken darmziekten. Sommige E. coli infecteren andere organen, deze worden extra-intestinale pathogene E. coli (ExPEC) genoemd. ExPEC die urineweginfecties veroorzaken staan ​​bekend als uropathogene E. coli (UPEC). Buiten ziekenhuizen worden de meeste urineweginfecties veroorzaakt door UPEC stammen. Hoewel UPEC intensief werden onderzocht, zijn er tot nu toe geen vaccins of effectieve behandelingen, met uitzondering van antibiotica, beschikbaar voor UPEC infecties. Een gedetailleerd begrip van de moleculair-genetische basis van de virulentie van UPEC kan bijdragen tot de ontwikkeling van meer effectieve profylactische maatregels en behandelingen.

Vergelijking van volledige genoomsequenties en epidemiologisch onderzoek hebben aangetoond dat UPEC meer dan 50% van hun genen delen met met commensale E. coli en met andere ExPEC en dat de klinische isolaten behoren tot verschillende fylogenetische groepen en serotypen.

Virulentiefactoren zijn de munitie die de bacteriële pathogenen toelaat zich te hechten aan de epitheelcellen van de organen van de gastheer, te ontsnappen aan de afweermechanismen van de gastheer, binnen te dringen in de weefsels van de gastheer, in de gastheer te overleven en / of ziekte te veroorzaken. Het moleculaire mechanisme van de pathogenese en de regulatie van de uitdrukking van de virulentiefactoren werden reeds intensief onderzocht. De interactie van UPEC met hun gastheer is echter vrij complex. UPEC stimuleren aan de hand van verschillende virulentiefactoren een aantal reacties van de gastheer, met inbegrip van de apoptose, immune en inflammatoire reacties, endocytose van UPEC en de verspreiding van de bacteriën in intracellular bacterial communities (IBC) in blaasepitheelcellen.

In deze studie hebben we eerst het moleculaire mechanisme ontcijferd van de NAD afhankelijkheid van E. coli UTI89, een acute cystitis isolaat van het serotype O18:K1:H7. Een mutatie in het nadB gen, coderend L-aspartaat oxidase, bleek verantwoordelijk voor de nicotinamide auxotrofie van UTI89. Dit werd verder bevestigd door de complementatietest. Constructie van plaatsspecifieke puntmutaties, selectie en analyse van spontane prototrofe revertanten en sequencing van het nadB gen van andere NAD-afhankelijke en onafhankelijke O18 isolaten heeft aangetoond dat de Ala28Val mutatie in NadB volledig de de novo synthese van nicotinamide belemmert. Er werden echter geen significante verschillen waargenomen tussen de virulentie van isogene NAD-auxotrofe en prototrofe stammen in het muismodel voor urineweginfecties. We gebruikten de nadB locus als neutrale site voor DNA inserties in het bacteriële chromosoom, i.e. andere genen werden stabiel ingebracht in het middengebied van het nadB gen om geïnactiveerde genen elders op het chromosoom te complementeren. Dergelijke complementatie moet de identificatie van genen als virulentiefactoren bevestigen en is vaak moeilijk uit te voeren met behulp van plasmiden, aangezien deze vaak in vivo te frequent verloren gaan.

Het gebruik van het alkalisch fosfatase gen phoA als reporter in UTI89 wordt gehinderd door de aanwezigheid van een endogeen phoA-gen, dat een hoge achtergrondactiviteit veroorzaakt. Daarom hebben we besloten om eerst een UTI89ΔphoA mutant de te construeren. Aangezien de toepassing van het Red recombinatiesysteem in UTI89 niet efficiënt bleek, werd de mutatie eerst geconstrueerd in de E. coli K-12 stam BW25141. Vermits bleek dat geen hoge titer lysaten van de transducerende faag P1vir konden geproduceerd worden op BW25141ΔphoA::cat, werd de ΔphoA::cat mutatie eerst door P1vir getransduceerd naar de wildtype E. coli K-12 stam MG1655 en vervolgens nogmaals via P1vir transductie naar UTI89 overgebracht om de UTI89ΔphoA::cat mutant DV7728 te verkrijgen. Tegelijkertijd stelden we vast dat de phoA flankerende sequenties vrijwel identiek zijn tussen UTI89 en E. coli K-12. Daarom werden langere flankerende sequenties gebruikt om de phoA deletie over te dragen naar UTI89, door Red-gemedieerde recombinatie van een lineair fragment dat uit DV7728 werd geamplificeerd door PCR. De resulterende UTI89ΔphoA mutant DV7748 werd gebruikt als een recipiëntstam voor de constructie van een transposonmutant bibliotheek door conjugatie met de donor stam E. coli S17-1 (λpir)(pGV4220), die een phoA reportergen in het miniTn5phoA2 transposon bevat.

Dan hebben we gebruik gemaakt van het verschil tussen de auxotrofe merkers van DV7748 en S17 1(λpir) om een ​​transposon insertiemutanten bibliotheek te verkrijgen. De transposon insertiemutanten werden geselecteerd op minimaal A medium met nicotinamide en kanamycine en vervolgens verder getest op LB medium met het PhoA substraat 5-broom-4-chloor-3-indolylfosfaat (X-P). Een set van 103 miniTn5phoA2 insertiemutanten werd geanalyseerd en de inserties van 96 mutanten werden gelokaliseerd. In totaal werden 91 discrete inserties geïdentificeerd. Het fenotype van deze mutanten werd getest in vitro en in vivo. De overleving van Caenorhabditis elegans gevoed met mutant 26, met een geïnactiveerd wciP gen, was statistisch significant langer dan die van C. elegans gevoed met de wild type stam. Verder screenen op mutanten met een verminderde kolonisatie in de blaas en nieren van C3H/HeN-muizen, heeft aangetoond dat tatA, pstC, nhaA, degP, yohJ en de plasmide-gecodeerde eiwitten P060 en P135 potentiële virulentiedeterminanten zijn van UTI89. Vergelijking van de gegevens verkregen met C. elegans en met muizen heeft aangetoond dat verscheidene mutaties die de virulentie bij de muis verminderen niet de levensduur van geïnfecteerde C. elegans verlengen en dus niet zouden geïdentificeerd worden indien de screening alleen wordt uitgevoerd in nematoden.

Met lineaire fragmenten, die door PCR waren geamplificeerd uit het chromosoom, werden de degP en yohJ transposoninsertie mutaties uit de bibliotheek door transformatie overgebracht naar wild type UTI89 en UPEC CFT073. Dergelijke constructie van isogene stammen in een schone genetische achtergrond is noodzakelijk om de koppeling tussen een mutant fenotype en een geïnactiveerd gen aan te tonen. De resultaten toonden aan dat de mucoïde koloniemorfologie van de yohJ transposon insertiemutant het gevolg is van een ongekoppelde mutatie maar niet van de inactivering van yohJ. Vergelijking van de infectie in de blaas en nieren met degP mutanten en wild type stammen in het muismodel, bevestigde dat degP een belangrijke rol speelt bij de infectie, zowel bij het cystitis isolaat UTI89 als bij het pyelonefritis isolaat CFT073. De functie van degP is echter in een vroeger stadium nodig voor de kolonisatie door CFT073 bij UTI89.

Verschillende mutaties inactiveerden eveneens genen op het endogene plasmide pUTI89. Het plasmide-gecodeerde eiwit ParB werd geïdentificeerd als noodzakelijk voor de volledige virulentie van UTI89. Het is één van de eiwitten gecodeerd door het parAB plasmideverdelingssysteem, dat verantwoordelijk is voor de verdeling van de plasmiden tussen de dochtercellen bij de celdeling. We verkregen plasmide-vrije cellen wanneer slechts één van de genen, parB of parA, werd vervangen door een resistentiemerker. We konden echter geen plasmide-vrije cellen isoleren van de parAB mutant waarbij beide genen ontbreken. Bovendien kan het plasmide pCP20, dat codeert voor het gist FLP recombinase, niet stabiel repliceren in de parB mutant, wat een interactie tussen een genproduct in de parB mutant en het plasmide pCP20 impliceert.



Concluderend, de huidige studie ontdekte het moleculaire mechanisme van de NAD afhankelijkheid van O18 UPEC stammen, ontwikkelde een algemene methode om mutaties tussen E. coli stammen over te dragen en beschrijft een nieuwe neutrale insertieplaats in het chromosoom voor complementatie-assays. Plasmide-vrije UTI89 derivaten werden geïsoleerd door mutatie van het plasmide verdelingsgen p060. Dit parB gen werd voor het eerst bevestigd als noodzakelijk voor de volledige virulentie van UPEC in het muismodel.





De database wordt beschermd door het auteursrecht ©opleid.info 2017
stuur bericht

    Hoofdpagina