Mcb: Hoofdstuk 9



Dovnload 177.99 Kb.
Pagina1/4
Datum27.08.2016
Grootte177.99 Kb.
  1   2   3   4
MCB: Hoofdstuk 9:
In de vorige chapters, werden we ingeleid in de varieteit van taken die proteïnen uitvoeren in biologische systemen. Hoe sommige proteïnen hun specifieke taken uitvoeren wordt meer in detail beschreven in de volgende chapters. Bij het bestuderen van een nieuw ontdekt eiwit beginnen celbiologen gewoonlijk bij het vragen naar zijn functie, zijn lokatie, zijn structuur, ... Om deze vragen te beantwoorden, gebruiken onderzoekers drie werktuigen: het gen dat codeert voor het eiwit, een mutante cellijn of organisme dat de functie van het proteïne ontbreekt en een bron van opgezuiverd proteïne voor biochemische studies. In dit hoofdstuk beschouwen we de verschillende aspecten van twee basis experimentele strategieën voor het verkrijgen van de drie werktuigen.
De eerste strategie, vaak naar gerefereerd als de classical genetics, begint met de isolatie van een mutant die gebrekkig lijkt in het proces van interesse. Genetische methoden worden dan gebruikt om het getroffen gen te identificeren, dat daarna geïsoleerd wordt van de gepaste DNAlibrary , een grote collectie van individuele DNA sequenties die alle of delen van het genoom van een organisme vertegenwoordigen. Het geïsoleerde gen kan gemanipuleerd worden om grote hoeveelheden van het proteïne te produceren voor biochemische experimenten en om probes te ontwerpen voor studies naar het waar en wanneer het gecodeerde eiwit tot uitdrukking komt in een organisme. De tweede strategie volgt grotendeels dezelfde stappen als de klassieke aanpak maar in de omgekeerde volgorde, begind met de isolatie van het proteïne van interesse of zijn identificatie gebaseerd op analyses van de genoomssequentie van een organisme. Eenmaal het overeenkomende gen geïsoleerd is van een DNAlibrary, kan het gen veranderd worden en dan terugingevoegd in een organisme. Door het observeren van de effecten van het veranderde gen op het organisme, kunnen onderzoekers vaak afleiden wat de functie van het normale eiwit is.
Een belangrijke component in beide strategieën voor de studie van proteïnen en zijn biologische functie is de isolatie van het overeenkomstige gen. Dus zullen we de verschillende technieken volgens dewelke onderzoekers kunnen isoleren, opeenvolgen(?) en manipuleren van specifieke gebieden van het DNA van een organisme. De extensieve collecties van DNAsequenties die vergaard zijn in de laatste jaren heeft geleid tot een nieuw studiegebied, genomics genaamd. De moleculaire karakterisatie van een heel genoom en de globale schema’s van genexpressie. Verschillende voorbeelden van soorten informatie beschikbaar van zulke genoom-wijde analyse worden ook voorgesteld.
9.1 genetische analyse van mutaties voor identificatie en genstudies

Zoals beschreven in chap4, de informatie gecodeerd in de DNAsequentie van genen bepaalt de sequentie en daarmee de structuur en functie van elk proteïnemolecule in een cel. De kracht van genetica als een hulpmiddel in de studie van cellen en organismen ligt in het vermogen van onderzoekers om selectief elke kopie van juist één type van proteïne in een cel te veranderen, door een verandering aan te brengen in het gen van dat eiwit. Genetische analyse van mutanten gebrekkig in een bepaald proces kan onthullen (a) nieuwe genen nodig om het proces te laten plaatst vinden; (b) de orde(?) in dewelke genproducten in het proces; en (c) of de proteïnen gecodeerd door verschillende genen met elkaar interageren. Voordat we bekijken hoe genetische studies van deze soort inzichten kunnen leveren in het mechanisme van gecompliceerde cellulaire of ontwikkelingsprocessen, zullen we enkele genetische basistermen uitleggen die gebruikt worden in onze verdere bespreking.


De verschillende vormen of varianten van een gen worden allelen genoemd. Genetici refereren gewoonlijk naar de talrijke natuurlijke genetische varianten die bestaan in een populatie, in het bijzonder in de menselijke populatie, als allelen. De term mutatie wordt gewoonlijk gebruikt voor gevallen in de welke een alleel als pas gevormd geweten is, zoals na de behandeling van een experimenteel organisme met een mutagen, een stof die een erfelijke verandering veroorzaakt in de DNAsequentie.

Strikt genomen, de individuele set van allelen voor alle genen van een individu is zijn genotype. Nochtans wordt deze term ook gebruikt in meer beperkte betekenis om juist de allelen van een bepaald gen of bepaalde genen van onderzoek aan te duiden. Voor experimentele organismen wordt de term wild-type vaak gebruikt om een standaard genotype voor gebruik als referentie aan te duiden in fokkingexperimenten. De normale, niet-mutante alleel zal gewoonlijk aangeduid worden als wild-type. Vermits de enorme, natuurlijk optredende, allelische variatie die bestaat binnen de menselijke populatie, duidt de term wild-type gewoonlijk een alleel aan dat met een veel grotere frequentie voorkomt dan enig ander mogelijk alternatief.

Genetici maken een belangrijk onderscheid tussen het genotype en het fenotype van een organisme. Het fenotype verwijst naar alle natuurlijke kenmerken of karaktertrekken van een individu die een gevolg zijn van het gegeven genotype. In de praktijk wordt de term fenotype echter vaak gebruikt om de fysieke gevolgen van juist de onderzochtte allelen aan te duiden. Gemakkelijk observeerbare fenotypische kenmerken zijn cruciaal in de genetische analyses van mutaties.
Recessieve en dominante mutant allelen hebben gewoonlijk een tegengesteld effect op de genfunctie

Een fundamenteel genetisch verschil tussen experimentele organismen is of hun cellen een enkele set chromosomen of twee copieën van elk chromosoom dragen. De eerstgenoemde noemt men haploïd; de laatstgenoemde diploïd. Complexe meercellige organismen (vb fruitvlieg, muis, mens) zijn diploid, terwijl vele eenvoudige eencellige organismen haploid zijn. Sommige organismen, met name gist Saccharomyces, kunnen zowel in een haploide als in een diploide toestand bestaan. Vele kankercellen en de normale cellen van sommige organismen, zowel in planten als in dieren, dragen meer dan twee kopieën van elk chromosoom. Nochtans heeft onze discussie omtrent genetische technieken en analysen betrekking op diploide organismen, inclusief gist.


Vermits diploide organismen twee kopieën van elk gen dragen, kunnen ze twee identieke allelen dragen, dat is wanneer ze homozygoot zijn voor een gen, of verschillende allelen dragen, dat is wanneer ze heterozygoot zijn voor een gen. Een recessief mutant alleel is een waarvoor beide allelen mutant moeten zijn opdat het mutante fenotype tot uiting komt; dat houdt in dat het individu homozygoot moet zijn voor het mutunt alleel om het mutante fenotype te tonen. In tegenstelling daarmee kunnen de fenotypische gevolgen van een dominant mutant alleel geobserveerd worden in een heterozygoot individu, dragen van één mutant en één wild-type alleel.

Of een mutant alleel recessief of dominant is, verschaft waardevolle informatie over de functie van het getroffen gen en de aard van de veroorzakende mutatie. Recessieve allelen zijn gewoonlijk het gevolg van een mutatie die het getroffen gen inactiveerd, leidend tot een gedeeltelijk of geheel verlies van functie. Zulke recessieve mutaties kunnen een deel of een heel gen van het chromosoom verwijderen, de expressie van dit gen verstoren of de structuur van het gecodeerde eiwit wijzigen, en daarmee ook zijn functie. Daarentegen zijn dominante genen vaak het gevolg van een mutatie die een soort winnen van functie veroorzaakt. Zulke dominante mutaties kunnen de activiteit van het gecodeerde eiwit verhogen, het een nieuwe activiteit verlenen of leiden tot zijn onaangepaste ruimtelijke of tijdelijke(?) patroon van expressie.


Dominante mutaties in bepaalde genen daarentegen worden geassocieerd met een verlies van functie. Bijvoorbeeld: sommige genen zijn haplo-insufficient, dit houdt in dat beide allelen nodig zijn voor het normaal functioneren. Verwijdering of inactivering van een enkel alleel in zulk gen leidt tot een mutant fenotype. In andere uitzonderlijke gevallen kan een dominate mutatie in een van de allelen leiden tot een structurele verandering in het eiwit dat interfereert met de functie van het wild-type proteïne gecodeerd door een ander alleel. Dit type van mutatie, negatieve dominantie genoemd, veroorzaakt een fenotype gelijkaardig met dat bereikt door een verlies-van-functie mutatie.
Sommige allelen kunnen zowel recessieve als dominante kenmerken vertonen. In zulke gevallen moeten uitspraken over af het alleel dominant is of recessief gespecifieerd worden door het fenotype(???). Bijvoorbeeld: het alleel van het hemoglobuline gen in mensen, aangeduid als Hbs, heeft meer dan één fenotypisch gevolg. Individuen die homozygoot zijn voor dit alleel (Hbs/Hbs) hebben de afmattende ziekte sikkelcelanemie, maar heterozygote individuen (Hbs/Hba) hebben de ziekte niet. Daarmee is Hbs recessief voor het kenmerk van sikkelcelanemie. Aan de andere kant zijn heterozygote individuen (Hbs/Hba) meer resistent aan malaria dan homozygote individuen (Hba/Hba), onthullend dat Hbs dominant is voor het kenmerk van malariaresistentie.
Een veel gebruikte stof voor het induceren van mutaties (mutagenese) in experimentele organismen is ethylmethaan sulfonaat (EMS). Hoewel dit mutagen DNAsequenties op verschillende manieren kan veranderen, is een van zijn meest voorkomende effecten het chemisch modificeren van guaninebasen in DNA, wat uiteindelijk leidt tot de conversie van een G-C base paar in een A-T basepaar. Zulke verandering in de sequentie van een gen die een enkel basepaar bevat, is gekend als aan puntmutatie. Een stille puntmutatie veroorzaakt geen verandering in de aminozuursequentie of de activiteit van het door het gen gecodeerde proteïne. Echter observeerbare fenotypische gevolgen te wijten aan de activiteit van een proteïne kan ontstaan van puntmutaties die resulteren in de vervanging van een aminozuur in een ander (missence mutatie), de introductie van een voortijdig stopcodon (nonsense mutatie), of een verandering in het leesraam (frameshift mutatie). Vermits veranderingen in de DNAsequentie leidend tot een daling in de proteïneactiviteit veel waarschijnlijker zijn dan veranderingen die leiden tot een toename of kwalitatieve verandering in de eiwitactiviteit, mutagenese produceert gewoonlijk veel meer recessieve mutaties dan dominante mutaties.
Segregatie van mutaties in broedings experimenten onthult hun dominantie of recessitiviteit
Conditionele mutaties kunnen gebruikt worden om essentiële genen te bestuderen in gist

De producedures gebruikt om mutanten te identificeren en isoleren, naar verwezen als genetic screens, hangen af of het experimentele organisme haploid of diploid is en, in het laatste geval of mutatie recessief of dominant is. Genen die coderen voor essentiële proteïnen voor het leven zijn bij de meest interessante en belangrijksten om te bestuderen. Vermits de fenotypische expressie van mutaties in essentiële genen leidt tot de dood van het individu, zijn vernuftige genetic screens nodig om organismen te isoleren en in stand te houden met een dodelijke mutatie.


In haploide gistcellen, kunnen essentiële genen bestudeerd worden door het gebruik van conditionele mutaties. Tussen de meest voorkomende conditionele mutaties zijn temperatuurs-gevoelige mutaties, die geïsoleerd kunnen worden in bacteria en lagere eukaryoten, maar niet in warmbloedige eukaryoten. Bijvoorbeeld: een mutant proteïne kan volledig functioneel zijn bij een bepaalde temperatuur (vb 23°C) maar volledig inactief bij een andere temperatuur (vb 36°C), daar waar een normaal eiwit volledig functioneel zou zijn bij beide temperaturen. Een temperatuur bij de welke een mutant fenotype geobserveerd wordt, noemt men nonpermissief; een permissieve temperatuur is één aan de welke het mutant fenotype niet waargenomen kan worden, zelfs als het mutant alleel aanwezig is. Alzo kunnen vervormingen behouden worden aan een permissieve temperatuur en dan gesubcultureerd worden aan een nonpermissieve temperatuur voor de analyse van het mutante fenotype.
Een voorbeeld van een bijzonder belangrijk screen voor temperatuur-sensitieve mutanten in het gist Saccharomyces cerevisiae komt van de studies van L. H. Hartwell en zijn collega’s in de late jaren 60 en vroege jaren 70. Ze (???) het identificeren van genen belangrijk in de regulatie van de celcyclus tijdens dewelke een cel proteïnen synthetiseert, zijn DNA repliceert en dan een mitotische celdeling ondergaat, waarbij elke dochtercel een kopie van elk chromosoom krijgt. Exponentiële groei van een enkele gistcel voor 20-30 celdelingen vormt een zichtbare gistkolonie op een solid agar medium. Vermits mutanten met een een volledige block in de celcyclus niet in staat zouden zijn een gistkolonie te vormen, waren conditionele mutanten nodig om mutaties te bestuderen die dit basiscelproces treffen. Om voor zulke mutanten te screenen, identificeerden onderzoekers eerst de gemutageniseerde gistcellen die normaal konden groeien bij 23°C maar geen kolonie konden vormen bij 36°C.
Eens de temperatuursgevoelige mutanten geisoleerd waren, onthulde verdere analyse dat ze inderdaad gebrekig waren in celdivisie. Bij S. Cerevisiae gebeurde celdeling door een aankomend(???) proces en de grootte van de knop(??), die gemakkelijk zichtbaar is door een lichtmicroscoop, duidt de positie van de cel aan in de celcyclus. Elke mutant die niet kon groeien bij 36°C werd onderzocht door microscopie na verschillende uren aan een non-permissieve temperatuur. Het onderzoek van vele verschillende temperatuursgevoelige mutanten onthulde dat ongeveer 1% een duidelijke block vertoonde in de celcyclus. Deze mutanten werden daarom aangeduid als cdc (cell-division-cycle) mutanten. Belangrijk is dat deze gistcellen niet eenvoudigweg faalden te groeien, zoals ze konden doen als ze een mutatie droegen die het generale cellulaire metabolisme trof. Juister, bij een nonpermissieve temperatuur, groeiden de mutanten van interesse normaal voor een deel van de celcyclus, maar dan vastgehouden(??) bij een bepaald stadiuim in de celcyclus, zodat vele cellen in dit stadium te zien waren. De meeste cdc mutaties in gist zijn recessief; dat is wanneer haploide cdc strengen koppeld zijn met wild-type haploiden, de overblijvende heterozygote diploiden zijn nog temperatuursgevoelig, noch gebrekig in de celdeling.
Recessieve lethale mutaties in diploiden kunnen geïdentificeerd worden door inteelt en behouden in heterozygoten
Complementatie testen bepalen of er verschillende recessieve mutaties in hetzelfde gen
Dubbele mutanten zijn handig in het schatten van de mate volgens dewelke proteïnen functioneren
Genetische suppressie en synthetische dodelijkheid kan onthuld worden door interagerende of overtollige proteïnen
KEY CONCEPTS OF SECTION 9.1

Genetische analyses van mutaties om genen te identificeren en te bestuderen

Diploide organismen dragen twee kopieën (allelen) van elk gen, terwijl haploide organismen slechts één kopie dragen.

Recessieve mutaties leiden tot een verlies van functie, die verhuld wordt als een normaal alleel van het gen aanwezig is. Om het mutante fenotype te laten verschijnen moeten beide allelen de mutatie dragen.

Dominante mutaties leiden tot een mutant fenotype in de aanwezigheid van een normaal alleel van het gen. De fenotypen geassocieerd met dominante mutaties vertegenwoordigen meestal een winst in functie, maar in het geval van sommige genen resulteert het in een verlies van functie.

Tijdens de meiose ondergaat een diploide cel één DNAreplicatie en twee celdelingen, vier haploide cellen vormend in dewelke maternale en paternale allelen willekeurig gemengd zijn.

Dominante en recessieve mutaties vertonen karakteristieke segregatie patronen in genetische kruisingen.

In haploide gist, temperatuursgevoelige mutaties zijn bijzonder handig voor het identificeren en bestuderen van genen essentieel voor het overleven van het organisme.

Het aantal functioneel verbonden genen betrokken in een proces kan bepaald worden door aanvullende analyses.

De orde(?) in dewelke genen functioneren zowel in biosynthetische paden als in signaal paden kan afgeleid worden van het fenotype van dubbele mutanten gebrekig in twee stappen van het getroffen proces.

Functioneel belangrijke interacties tussen proteïnen kunnen afgeleid worden van de fenotypische effecten van alleelspecifieke suppressor mutaties of synthetische lethale mutaties.


9.2 DNA klonering door recombinant DNA methoden

Gedetailleerde studies van de structuur en functie van een gen op het moleculaire niveau vereist grote hoeveelheden van een individueel gen in zijn zuivere vorm. Een verscheidenheid aan technieken, vaak recombinant DNAtechnologie genoemd, worden gebruikt voor DNAkloning, dewelke onderzoekers toelaat grote aantallen van eenzelfde identiek DNAmolecule te prepareren. Recombinant DNA is eenvoudigweg elk DNA molecule samengesteld uit sequenties van verschillende bronnen.


De sleutel om een DNAfragment van interesse te klonen is het te verbinden met een vektor DNA molecule, die kan repliceren in een gastheercel. Nadat een enkel recombinant DNA molecule, samengesteld uit een vektor en een tussengevoegd DNA fragment, is geintroduceerd in een gastheercel, zal het tussengevoegde DNA mee repliceren met de vektor, producerend een groot aantal van identieke DNAmoleculen. Het basisschema kan als volgt samengevat worden:

Vector + DNAfragment


recombinant DNA
replicatie van het recombinant DNA in de gastheercel


Isolatie, sequencing en manipulatie van het gezuiverde DNA fragment


Hoewel onderzoekers vele experimentele variaties bedacht hebben, duidt dit schema de essentiële stappen in DNA kloning aan. In deze sectie behandelen we de stappen in dit basisschema, ons concentrerend op twee types vektoren het meest gebruikt in E. Coli gastheercellen: plasmide vektoren, die repliceren met hun gastheercellen, en bacteriofaag λ vektoren, die repliceren als lytische virussen, de gastheercel dodend en hun DNA inpakkend in virions(???). We bespreken het karakteristieke en verschillende gebruik van gekloneerde DNAfragmenten in onderstaande secties.
Restrictie enzymen en DNA ligasen maken insertie van DNA fragmenten in kloningsvectoren mogelijk

Een belangrijk doel van DNAkloning is het verkrijgen van verschillende, kleine regionen van het DNA van een organisme dat opgebouwd is uit verschillende genen. Bovendien kunnen enkel relatief kleineDNAmoleculen gekloneerd worden in een van de beschikbare vektoren. Om deze redenen moeten erg lange DNA moleculen, die het genoom van een organisme samenstellen, gekliefd worden in fragmenten die tussengevoegd kunnen worden in het vektor DNA. Twee soorten enzymen –restrictie enzymen en DNA ligasen- vergemakkelijken de productie van zulke DNAmoleculen.


Het delen van DNAmoleculen in kleine fragmenten Restrictie-enzymen zijn endonucleasen geproduceerd door bacteriën die typische specifieke 4-tot 8bp sequenties herkennen, restrictie sites genoemd, en dan beide DNAstrengen klieven op dit punt. Restrictiesites zijn gewoonlijk korte palindroom sequenties; dat is, de restrictiesite sequentie is dezelfde aan elke DNAstreng wanneer gelezen wordt in de 5’-> 3’ richting.
Voor elk restrictie enzyme produceren bacteriën een modificatie enzyme, dat het DNA van de bacterie beschermt van klieving door het te modificeren op of bij elke mogelijke klievingssite. Het modificatie enzyme voegt een methylgroep toe aan één of twee basen, gewoonlijk in de restrictiesite. Wanneer een methylgroep daar aanwezig is, wordt het restrictie endonuclease verhinderd het DNA te snijden. Samen met het restrictie endonuclease, vormt het methylerend enzyme een restricite-modificerend systeem dat het gast DNA beschermt wanneer het binnenkomend vreemd DNA vernietigd (vb bacteriofaag DNA of DNA opgenomen tijdens transformatie) door het te klieven aan alle restrictie sites in het DNA.
Vele restrictie enzymen maken zigzag sneden in twee DNAstrengen bij hun herkenningssite, producerend fragmenten die een enkelstrengige ‘staart’ hebben aan beide einden. De staarten aan de fragmenten gegenereerd aan een gegeven restrictiesite zijn complementair aan deze aan alle andere fragmenten gegenereerd door hetzelfde restrictie enzyme. Bij kamertemperatuur kunnen deze enkelstrengige gebieden, vaak ‘sticky ends’ genoemd, kortstondig(?) baseparen met deze aan andere DNAfragmenten gegenereerd door eenzelfde restrictie enzyme. Enkele restrictie enzymen, zoals AluI en SmaI, klieven beide DNAstrengen op hetzelfde punt in de restrictie site, zodat fragmenten met ‘blunt’ (blind) ends geproduceerd worden in dewelke alle nucleotiden aan het fragmenteinde gebasepaard zijn met nucleotiden in de complementaire streng.
Het DNA geïsoleerd van een individueel organisme heeft een specifieke sequentie, die zuiver door toeval een specifieke set van restrictie sites zal bevatten. Dus een gegeven restricite enzyme zal het DNA van een bijzondere bron snijden in een reproduceerbare set van fragmenten, restrictie fragmenten genoemd. Restrictie enzymen zijn opgezuiverd uit honderden verschillende soorten bacteriën, zodat DNA moleculen gesneden kunnen worden aan een groot aantal verschillende sequenties die overeenkomen met de herkenningssites van deze enzymen.
Het tussenvoegen van DNAfragmenten in vektoren DNAfragmenten met ofwel sticky ends ofwel blunt ends kunnen ingevoegd worden in vektor DNA met de hulp van DNAligasen. Tijdens normale DNA replicatie, katalyseert DNA ligase het end-to-end verbinden (ligatie) van korte fragmenten DNA, Okazaki fragmenten genoemd. Voor doelen van DNA kloning wordt gezuiverd DNAligase gebruikt om de einden van een restrictiefragment en van het vektor DNA, dat complementaire einden heeft, covalent te verbinden. Het vektor DNA en het restrictie fragment zijn covalent samengebonden door de standaar 3’-> 5’ fosfodiester bindingen van DNA. Behalve het ligeren van complementaire sticky ends, kan het DNA ligase van bacteriofaag T4 elke twee blinde DNA einden ligeren. Blind-end ligatie is inherent(?) onefficient en vereist een hogere concentratie van zowel DNA als DNAligase dan voor de ligatie van sticky ends.
E. Coli plasmide vektoren zijn geschikt voor de klonering van geïsoleerde DNA fragmenten

Plasmiden zijn cirkulaire, dubbelstrengige DNA (dsDNA) moleculen die gescheiden zijn van het chromosomaal DNA van een cel. Deze extrachromosomale DNA’s, die van nature bestaan in bacteriën en in lagere eukaryote cellen (vb gist), staan in een parasitair of symbiotisch verband met hun gastcellen. Zoals het chromomaal DNA van de gastheer-cel wordt het plasmide DNA gedupliceerd voor elke celdeling. Tijdens celdeling scheiden de kopieën van het plasmide DNA in elke dochtercel, zodat de voortdurende doorgave van het plasmide verzekerd is door opeenvolgende generaties van de gastheercel.



De plasmiden die het meest gebruikt worden in recombinant DNA technologie zijn deze die repliceren in E. Coli. Onderzoekers hebben deze plasmide zo gemaakt dat ze geoptimaliseerd is voor haar gebruik als vektor in DNAkloning. Bijvoorbeeld: de verwijdering van onnodige gedeelten van de natuurlijk voorkomende E. Coli plasmiden levert plasmide vectoren op, ongeveer 1,2-3 kb in cirkelomtrek, dat drie regionen essentieel voor DNA klonering bevat: een origin of replication; een merker die selectie toelaat, gewoonlijk een drugresistentiegen; en een domein waarin exogenous(?) DNAfragmenten ingevoegd kunnen worden. Gastheercelenzymen repliceren een plasmide beginnend aan de replication origin (ORI), een specifieke DNA sequentie van 50-100 baseparen. Eens DNA replicatie begonnen is aan de ORI, gaat het verder rond het cirkulaire plamside ongeacht zijn nucleotidesequentie. Dus elke DNAsequentie ingevoegd in zulk plasmide is gerepliceerd met de rest van het plasmideDNA.
Figuur 9-13 schets de generale procedure voor het kloneren van een DNAfragment gebruik makend van E. Coli plasmide vektoren. Wanneer E. Coli cellen gemengd worden met recombinant vektor DNA zal onder bepaalde condities een kleine fractie van de cellen het plasmide DNA opnemen, een proces gekend als transformatie. Typerend wordt in één cel op de 1000 een enkel plasmide DNA molecule opgenomen en wordt dus getransformeert. Nadat de plasmidevektoren gekweekt(?) worden met de E. Coli, kunnen deze cellen dat een plasmide opgenomen hebben gemakkelijk geselecteerd worden van een veel groter aantal cellen. Bijvoorbeeld: als het plasmide een gen draagt dat resistentie verleent voor het antibioticum ampicilline, kunnen de getransformeerde cellen geselecteerd worden door hen te laten groeien in een ampicilline-bevattend medium.
DNA fragmenten van enkele tot +/- 20kb baseparen zijn gewoonlijk ingevoegd in de plasmide vektor. Als speciale voorzorgsmaatregelen zijn genomen om manupulaties te vermijden die DNA mechanisch kunnen openbreken, kunnen zelfs langere DNAfragmenten in een plasmide vektor gevoegd worden. Wanneer een recombinant plasmide met een ingevoegd DNAfragment een E. Coli transformeert, alle antibiotica resistente nakomelingscellen die ontstaan uit de initieel getransformeerde cel zal plasmiden bevatten met hetzelfde ingevoegde DNA. Het ingevoegde DNA wordt gerepliceerd samen met de rest van het plasmide DNA en scheidt(?) naar de dochtercellen naarmate de kolonie groeit. Op deze manier wordt het initieele fragment van DNA gerepliceerd in de kolonie van cellen in een groot aantal identieke kopieën. Vermits alle cellen in kolonie ontstaan van één enkele getransformeerde oudercel, vertegenwoordigen ze een kloon van cellen, en het initiële DNA fragment ingevoegd in de ouderlijke plasmide wordt als gekloond beschouwd of een DNAkloon.
De toepasbaarheid van een E. Coli plasmide vektor wordt verhoogd door de inbouw van een poplylinker, een synthetisch geproduceerde sequentiedie één kopie van verschillende restrictiesites bevat die nergens anders aanwezig zijn in de plasmide sequentie. Wanneer zulke vektor behandeld is met een restrictie enzyme dat een restrictie site herkend in de polylinker, zak de vector enkel geknipt worden in de polylinker. Nadien kan elk DNAfragment met gepaste lengte geproduceerd met hetzelfde restrictie enzyme ingevoegd worden in het geknipte plasmide met DNAligase. Plasmiden die een polylinker bevatten laten onderzoekers toe DNAfragmenten geproduceerd met verschillende restrictie enzymen te kloneren gebruik makend van dezelfde plasmide vektor, die de experimentele procedures vereenvoudigd.
Bacteriofaag λ vektoren laten de efficiente constructie van grote DNA bibliotheken toe

Vektoren gemaakt uit een bacteriofaag λ zijn ongeveer duizend keer efficiënter dan plasmide vektoren in het kloneren van grote aantallen van DNA fragmenten. Om die reden worden faag λ vektoren zijn wijd gebruikt DNA bibliotheken te maken, die hele collecties van DNA fragmenten omvatten die het genoom of expressed mRNA van een organisme voorsteld. Twee factoren zijn verantwoordelijk voor de grotere efficiëntie van de faag λ als een kloneringsvektor: de infectie van de E. Coli gastheercel door de λ virions(?) gebeurt met ongeveer een duizendkeer zo grote frequentie dan de transformatie door plasmiden, en veel meer λ klonen dan getransformeerde kolonies kan gekweekt en gedectecteerd worden op een enkele cultuurplaat.


Wanneer een λ virion een E. Coli infecteert, kan het een lythische cyclus van celgroei ondergaan tijdens dewelke het DNA van de faag is gerepliceerd en meer dan 100 complete nageslachtsfagen zijn samengesteld, die vrijkomen wanneer de geïnfecteerde cel barst. Als een staal van de λ faag is geplaatst in een vlak van E. Coli kweek op een petri schaaltje, zal elke virion één enkele cel infecteren. De daaropvolgende cycli van faag groei zal een zichtbaar vrije ruimte doen ontstaan, een plaque genoemd, waar de cellen gebarsten zijn en de faagpartikels vrijgekomen zijn.
Een λ virion bestaat uit een hoofd, dat het DNA genoom van de faag bevat, en een staart, die functioneert in het infecteren van E. Coli gastheelcellen. De λ genen coderend voor hoofd en staart proteïnen, net als voor de verschillende proteïnen die betrokken zijn in faag DNA replicatie en cel barsting, zijn gegroepeerd in discrete (afzonderlijke) domeinen van het +/- 50-kb viraal genoom. Het centraal gebied van het λ genoom daarentegen bevat genen die niet essentieel zijn voor het lythische pad. Het verwijderen van dit domein en het vervangen door een vreemd DNA fragment tot +/- 25kb lang levert een recombinant DNA op dat in vitro kan verpakt worden om een faag te vormen die in staat is te repliceren en plaques te vormen in een vlak van E. Coli gastheercellen. Het in vitro verpakken van recombinant λ DNA, die het in vivo assemblage proces nadoet, vereist voorgeassembleerde hoofden en staarten net als twee virale proteïnen.
Het is technisch haalbaar om λ faag kloneringsvektoren te gebruiken om een genomische bibliotheek te maken, dat is, een verzameling van λ klonen die gezamelijk alle DNA sequenties in het genoom van een bepaald organisme voorstellen. Desondanks geven zulke genomische bibliotheken voor hogere eukaryoten bepaalde experimentele moeilijkheden. Ten eerste bezitten de genen van zulke organismen gewoonlijk uitgebreide intron sequenties en zijn daardoor te groot om tussengevoegd te worden in een λ faag vektor. Als een resultaat zijn de sequenties van individuele genen in delen gebroken(??) en gedragen in meer dan één λ kloon (dit is ook waar voor plasmide klonen). Bovendien maken de aanwezigheid van intronen en lange intergenetische regionen in het genomisch DNA het vaak moeilijk de belangrijke delen van een gen te identificeren die werkelijk coderen voor proteïne sequenties. Dus zijn voor vele studies de cellulaire mRNA’s, die de niet-coderende regionen aanwezig in het genomische DNA ontbreken, handiger startmateriaal voor het maken van een DNA bibliotheek. Bij deze aanpak worden DNA kopieën van de mRNA’s, gecomplementaire DNA’s (cDNA’s) genoemd, gesynthetiseerd en gekloneerd in faag vektoren. Een grote verzameling van de overblijvende cDNA klonen, alle mRNA’s voorstellend expressed in een celtype, noemd men een cDNA bibliotheek.
CDNA’s gemaakt door de reverse transcriptie van cellulaire mRNA’s kunnen gekloneerd worden om cDNA bibliotheken te genereren

De eerste stap in het vervaardigen van een cDNA bibliotheek is het isoleren van het gehele mRNA van het celtype of weefsel van interesse. Door hun lange poly(A) staarten kunnen mRNA’s gemakkelijk gescheiden worden van de meer overheersende rRNA’s en tRNA’s aanwezig in een celextract door het gebruik van een kolom aan dewelke korte strengen thymidylate zijn verbonden met de matrix (??????).


De algemene procedure voor het vervaardigen van een λ faag cDNA bibliotheek van een mengeling van cellulaire mRNA’s wordt geschetst in figuur 9-15. Het enzyme reverse transcriptase, dat gevonden wordt in retrovirussen, wordt gebruikt om een DNA streng te synthetiseren complementair met elke mRNA molecule, beginnend van een oligo-dT-primer. De resulterende cDNA-mRNA hybride moleculen worden in verschillende stappen omgezet naar dubbelstrengige cDNA moleculen overeenkomend met alle mRNAmoleculen in de oorspronkelijke preparatie. Elke dubbelstengige cDNA bevat een oligo-dC . oligo-dG dubbelstrengige regio aan het ene einde en een oligo-dT.oligo-dA dubbelstrengige regio aan het andere einde. De methylatie van het cDNA beschermt het tegen latere klieving door een restricie enzyme.
Om dubbelstrengige cDNA’s klaar te maken voor klonering, worden korte dubbelstrengige DNA-moleculen de herkenningssite voor een bepaald restrictie-enzyme bevattend geligeerd aan beide einden van de cDNA’s gebruik makend van DNAligase van bacteriofaag T4. Zoals vroeger vermeld kan dit ligase ‘blunt-ended’ dubbelstrengige DNA-moleculen zonder sticky ends verbinden. De resulterende moleculen worden dan behandeld met het restrictie enzyme specifiek voor de aangehechtte linker, cDNAmoleculen producerend met sticky ends aan elk einde. In een aparte procedure wordt λ DNA eerst behandeld met hetzelfde restrictie enzyme om fragmenten te produceren λ vektor armen genoemd, die sticky ends hebben en samen alle genen bevatten noodzakelijk voor lythische groei.
De λ armen en de verzameling van cDNA’s, allen complementaire sticky ends bevattend, worden dan gemengd en verbonden door DNA ligase. Elk van de resulterende recombinant DNA moleculen bevatten een cDNA gelokaliseerd tussen de twee armen van het λ vektor DNA. Virions die de geligeerde recombinant DNA’s bevatten zijn dan geassembleerd in vitro zoals hierboven beschreven. Enkel de DNAmoleculen met de juiste grootte kunnen verpakt worden om geheel infecteuze recombinant λ fagen te produceren (??). Ten slotte worden de recombinant λ fagen geplaatst op een veld van E. Coli cellen om een groot aantal individuele plaques te genereren.
Vermits elke plaque ontstaat van een enkele recombinant faag, zijn alle nageslachts λ fagen die ontwikkelen genetisch identiek en vormen een kloon die een cDNA draagt afkomstig van een enkele mRNA; gezamelijk vormen ze een λ cDNA bibliotheek. Eén kenmerk van cDNA bibliotheken ontstaat doordat verschillende genen met een verschillende snelheid getranscripteerd worden. Als resultaat zullen cDNA klonen overeenkomstig met snel getranscripteerde genen vele keren in een cDNA bibliotheek voorkomen, terwijl cDNA’s overeenkomstig met traag getranscripteerde genen extreem zelden of helemaal niet aanwezig zijn. Dit kenmerk is een voordeel als de onderzoeker geïnteresseerd is in een gen dat met een hoge snelheid afgeschreven wordt in een bepaald celtype. In dit geval zal een cDNA bibliotheek vervaardigd van mRNA’s expressed in dat celtype rijk zijn aan het cDNA van interesse, vergemakkelijkend het screenen van de bibliotheek voor λ klonen die dat cDNA dragen. Daarentegen hebben een aanzienlijke kans dat de ingesloten genen overeenkomen met traag afgelezen genen, cDNA bibliotheken van zoogdieren moeten 106-107 individuele recombinante λ faag klonen bevatten.
DNA bibliotheken kunnen gescreend worden door hybridisatie met een oligonucleotide probe

Zowel genomische als cDNA bibliotheken van verschillende organismen bevatten honderd duizenden tot een miljoen individuele klonen in het geval van eukaryoten. Twee algemene benaderingen zijn beschikbaar voor het screenen van bibliotheken om klonen te identificeren die een gen of een andere DNA regio dragen van interesse: (1) detectie met oligonucleotide probes die binden aan de kloon van interesse en (2) detectie gebaseerd op de expressie van het gecodeerde eiwit; een voorbeeld van de tweede methode wordt in de volgende sectie voorgesteld.


De basis voor screening met oligonecleotide probes is hybridisatie, het vermogen van complementaire enkelstrengige DNA of RNA moleculen te associëren (hybridiseren) specifiek met elke andere via baseparing. Zoals besproken in Chapter 4 kan dubbelstrengige (duplex) DNA gedenatureerd (gesmolten) worden in enkelstrengige strengen door verwarmen in een verdunde zout oplossing. Als de temperatuur dan verlaagd wordt en de ionenconcentratie verhoogd, zullen de complementaire enkele strengen reassociëren (hybridiseren) in dyplexen. In een mengeling van nucleïne zuren zullen enkel complementaire enkele strengen (of strengen complementaire regionen bevattend) terug associëren; bovendien is hun mate van reassociatie bijna niet beïnvloed door de aanwezigheid van nietcomplementaire strengen.
In de membrane-hybridization assay geschetst in figuur 9-16 wordt een enkelstrengige nucleïne zure probe gebruikt om die DNA fragmenten in een mengeling te detecteren die complementair zijn met de probe. Het DNA sample wordt eerst gedenatureerd en de enkele strengen verbonden aan een stevige steun, gewoonlijk een nitrocellulose filter of een behandeld nylon membraan. Het membraan wordt dan geïncubeerd in een oplossing die een radioactieve probe bevat. Onder hybridisatie condities (bijna neutrale pH, 40-65°C, 0,3-0,6 M NaCl) hybridiseerd deze gelabelde probe met elke complementaire nucleïnezure streng gebonden op het membraan. Elke overmatige probe die niet gehybridiseerd is, wordt weggewassen, en de gelabelde hybriden worden gedetecteerd door autoradiografie van de filter.
Een toepassing van deze procedure voor het screenen van een λ cDNA bibliotheek wordt beschreven in figuur 9-17. In dit geval, een replica van het petri dish een groot aantal intividuele λ klonen bevattend wordt initieel gereproduceerd op het oppervlak van een nitrocellulose membraan. Het membraan wordt dan geanalyseerd gebruik makend van een radiogelabelde probe specifiek voor het recombinant DNA dat het fragment van interesse bevat. Membraan hybridisatie met radiogelabelde oligonucleotiden is het meest gebruikt om λ cDNA bibliotheken te screnen. Eens een cDNA kloon coderend voor een bepaald proteïne bekomen is, kan het volledige cDNA geradiolabeld worden en gebruikt worden om een genomische bibliotheek te doorzoeken voor klonen die fragmenten van het overeenkomstige gen bevatten.
Oligonucleotide probes zijn ontworpen gebaseerd op gedeeltelijke proteïnesequenties

Het is duidelijk dat de identificatie van specifiek klonen door de membraanhybridisatie techniek afhangt van de beschikbaarheid van complementaire radiogelabelde probes. Opdat een oligonucleotide handig zou zijn als probe, moet het lang genoeg zijn opdat zijn sequentie enkel in de kloon van interesse zou voorkomen en niet in enige andere kloon. Voor de meeste doelen is deze voorwaarde vervuld met oligonucleotiden die ongeveer 20nucleotiden bevatten. Dit is omdat een specifieke 20-nucleotide sequentie eens in elke 420 (+/- 1012) nucleotide voorkomt. Vermits alle genomen veel kleiner zijn (+/- 3X109 nucleotiden bij de mens), komt een specifieke 20-nucleotiden sequentie in een genoom gewoonlijk slechts één keer voor. Oligonucleotiden van deze lengte met een specifieke sequentie kunnen chemisch gesynthetiseerd worden en dan geradiolabeld door polynucleotide kinase te gebruiken om een 32P-labeled fosfaat groep van ATP te transfereren naar het 5’ einde van elke oligonucleotide.


Hoe kan een onderzoeken een oligonucleotide ontwerpen om een cDNA kloon te identificeren die codeert voor een bepaald proteïne? Als de hele of een deel van de aminozuursequentie van het proteïne gekend is, kan een DNAprobe overeenkomstig met een kleine regio van het gen ontworpen worden gebaseerd op de genetische code. Vermits de genetische code gedegenereerd is (vele AZ worden gecodeerd door meer dan één codon), moet een probe gebaseerd op een aminozuursequentie echter alle mogelijke oligonucleotiden insluiten die theoretisch zouden kunnen coderen voor die peptide sequentie. In deze mengeling van oligonucleotiden zal er één zijn die perfect hybridiseert met de kloon van interesse.
In de laatste jaren werd deze aanpak vereenvoudigd door het beschikbaarheid van de volledige genomische sequenties van de mens en sommige belangrijke modelorganismen zoals de muis, de drosophila en de rondworm Caenorhabditis Elegans.Gebruikmakend vaan aangepast computerprogramma, kan een onderzoekers zoeken in de genomische sequentie database naar de coderende sequentie die overeenkomt met een specifiel deel van de aminozuursequentie van het proteïne dat bestudeerd wordt. Als een overeenkomst gevonden wordt, dan kan een enkele, unieke DNA probe gebaseerd op deze gekende genomische sequentie perfect hybridiseren met de kloon coderend voor het eiwit onder studie.
De chemische synthese van enkelstrengige DNA probes van een bepaalde sequentie kunnen volbracht worden door de reeks reacties getoond in figuur 9-18. Met de geautomatiseerde instrumenten nu beschikbaar, kunnen onderzoekers de synthese van oligonucleotiden met een specifieke sequentie tot ongeveer 100nucleotiden lang programmeren. Als alternatief kunnen deze probes vervaardigd worden door de polymerase keten reactie (PCR), een wijd gebruikte techniek voor het vermeerderen van specifieke DNA sequenties. Deze techniek wordt later beschreven.
Gist genomische bibliotheken kunnen gebouwd worden met shuttle vektoren en gescreend door functionele complementatie

/



  1   2   3   4


De database wordt beschermd door het auteursrecht ©opleid.info 2017
stuur bericht

    Hoofdpagina