Morfologische wetenschap (mbt structuren, vorm en bouw van levende organismen) normale microscopische bouw



Dovnload 0.57 Mb.
Pagina1/6
Datum21.08.2016
Grootte0.57 Mb.
  1   2   3   4   5   6
Cytologie en algemene histologie

cel => weefsel => orgaan (uit 2 of meer weefsels) => orgaansysteem (stelsel) => organisme


  • morfologische wetenschap (mbt structuren, vorm en bouw van levende organismen)

  • normale microscopische bouw plant/dier

  1. cytologie of celbiologie (1ste bach)

  2. algemene histologie (1ste bach)

  3. bijzondere histologie = microscopische anatomie (2de bach)

cytologie (celbiologie) en histologie (weefselleer):

  • beschrijven normale structuren van cellen en weefsels op microscopisch niveau (LM 1en EM2)

  • basis fysiologie (leer der levensverrichtingen) en pathologie (ziekteleer)

  • door gebruik technieken verband leggen tss moleculaire /biochemische kenmerken en specifieke aanwezigheid in bep. gebieden v/d cel of in bep. celtypes of weefsels

    1. kleurtechnieken: (enzymekleuring, immunohistochemie, in situ-hybridisatie…)

    2. detectiemethoden: (fluorescentiemicroscoop, confocale microscoop…)

      •  categoriën, elk  niveau in organisatie van veelcelligen behandelen

A. cytologie bestudeert individuele cellen

B. algemene histologie bestudeert cellen met eenzelfde functie in hun coöperatief verband (weefsels)

4 weefsels:



    1. epitheel

    2. bind- en steunweefsel

    3. spierweefsel

    4. zenuwweefsel

C. bijzondere histologie organen en stelsels worden besproken
DEEL 1: prepareren en observeren van cellen (histologische technieken)

doel: cellen en weefsels observeerbaar maken voor LM/ EM

probleem: weinig licht (elektr) doorlatend / weinig contrast in biologisch materiaal

methodes:

  1. fixeren

  2. inbedden

  3. snijden

  4. kleuren of contrasteren

wrm specifieke procedures noodzakelijk om cellen en weefsels microscopisch te kunnen bestuderen?


beeld krijgen => lichtstralen moeten door weefsel dringen => biologisch materiaal meestal te dik en te weinig contrastverhogende componenten => geen structuurdetails

histologische technieken: weefsels dun snijden => contrast in weefsel =>structuurdetails



  1. fixeren

    • bewaren weefsels, behoud oorspr. structuur (denatureren eiwitten)

    • denaturatie:

  1. chemische fixatieven:betere morfologie

koude fixatie: snel doorwerken materiaal, bewaart beter epitopen voor immuunkleuringen

  1. invriezen: veel gebruikt in pathologie labo’s snelle diagnoses van biopten3, tumoren… nodig! (tijdens operatie…)

weefsel uit ‘in vivo’ situatie wegnemen => afbraakenzymen actief => degradatie weefsel

=> afbraakproces tegengaan:

activiteit enzymen stoppen: DENATURATIE EIWITTEN

structurele componenten bewaren

chemische fixatie:


  1. cross-linken = vernetten: formaldehyde (formol), gluteraldehydecel/ weefselcomponenten blijven bewaard

  2. neer slaan = precipiteren: alcholhol, aceton


artefacten (-80°C, vloeibaar N2 -196°C) = veranderingen tijdens fixatie in weefsel die afwijken v/d in vivo situatie

  1. structuurverandering (ontstaan holte, lacune rond kraakbeencellen)

  2. op een andere plaats voorkomen van componenten (glycogeendrift leverpreparaat)

slechte fixatie => in weefselcoupe: necrotische zone

B.inbedden


  • gefixeerde materiaal omwikkelen en doordringen met inbedmiddel

  • inbedmiddel:

    • substantie die in het weefsel indringt / hard wordt, materiaal snijdbaar in coupes (dunne plakjes) bv. parafine (meest gebruikt), hars, plastics

    • inbedmiddel = hydrofoob

gefixeerde materiaal moet hard zijn => licht door coupes

      1. goede coupes: inbedmiddel weefsel volledig binnendringen

      2. slechte coupes: ingebed materiaal met  hardheden slecht snijdbaar

hydrofobe inbedmiddelen weefsel binnendringen: weefsel bevat veel water (60%) ontwateren, in stijgende reeks alchoholbaden (30°,50°,70°,90°, absolute ethanol) ‘clearing’ => tolueen (mengbaar met alcohol en inbedmiddel)


‘alternatieve inbedmiddelen’ (minder stabiel => inferieure morfologie)

  1. hydrofobe harsen met hydrofiele groepen

  2. hydrofiele inbedmiddelen

C. snijden

    • hardheid inbedmateriaal => snijdbaar coupes

    • paraffine:

  • vrij zacht, coupes met minimale dikte 5m (doorlaatbaar voor licht)

  • inbedmiddel voor LM : coupes op draagglaasjes

  • verwarmd tot 55°C: smelt, indringen weefsel (groot aantal epitopen blijft bewaard)

  • makkelijk uit weefsel weg etsen

    • hars, plastics:

  • harder, coupes tot 70nm (doorlaatbaar voor elektronen)

  • inbedmiddel voor EM: coupes op metalen (Cu, Ni) roostertjes (grids)

  • polymerisatie hars: 60-65°C

  • meeste harsen moeilijk uit weefsel weg te etsen

temperatuur + wegetsen moeilijk: minder geschikt inbedmiddel voor immuunkleuringen

    • snijtoestel:

      • microtoom: stalen messen (voor paraffine)

      • ultramicrotoom: glazen / diamanten messen (voor harsen en plastics)


voorkeur paraffine:

        1. hars moet men eerst zeer goed verkleinen (kleine weefselstukjes inbedden) om dunne coupes te krijgen dus men gebruikt paraffine om OVERZICHTSCOUPES te bekomen

        2. hars minder geschikt voor immunokleuringen

        3. paraffine is goedkoper (minder gesofisticeerde apparatuur nodig)

D. kleuren of contrasteren



LM observatie

    • wit licht: spectrum van golflengtes (kleur)

    • contrast in coupes laag

    • kleurstoffen: (vaak) waterige oplossingen

    • coupes worden gedeparaffineerd (tolueen)


routinekleuring (voor LM, meest toegepast, beste resultaten) = heamatoxyline (blauw)-eosine (oranjerood) (HE)

  • gebaseerd op differentiële aanwezigheid zure (-) en basische (+) weefselbestanddelen

  • kern veel zure groepen (DNA,RNA, NISSL stof)

  • cytoplasma veel basische groepen (eiwitten met IEP bij basische pH-waarden )

  • kleurstoffen zelf:

    1. kationische (+) basische kleurstoffen (H) reageren met zure bestanddelen

    2. anionische (-) zure kleurstoffen (E) reageren met basische bestanddelen

  • basofiel = weefselcomponent die reageert met + kleurstof (kern)

  • eosinofiel = weefselcomponent die reageert met – kleurstof (cytoplasma)

kleuren histologische preparaten gebaseerd op in affiniteit van bep. kleurstoffen voor bep. weefselcomponenten


na toepassing HE kleuring: kern blauw, cytoplasma oranje-rood, toch blauwe korreling in cytoplasma = hoge concentratie – groepen  aanwezigheid ribosomen
figuur 1 p. 11 :zenuwcel: neuron

negatieve groepen in kern: DNA, RNA, NISSL stof (blauw: haematoxyline)

positieve groepen in cytoplasma: eosinekleuring (oranjerood)

negatieve groepen in cytoplasma: ribosomen (blauwe korreling)


CYTOCHEMIE (zie biochemie 2de bach)

organische stoffen: kleurbaarheid met HE

  1. proteïnen (eiwitten)

    • polymeren van AZ

    • basisstructuur AZ:

NH3+

|

R—CH



|

COO-



    • zure (COO- = carbonzuur) en basische (NH3+ = amine) groepen, overmaat afh. van IEP en pH

    • pH 6-7: eiwitten (cytoplasma) vooral + geladen  eosine



  1. nucleïnezuren: DNA & RNA

  • nucleotide:

    • pentose suiker (ribose, desoxyribose)

    • base (A,T,G,C,U)

    • fosforzuur (P)

  • vooral in kern  Haematoxyline




  1. koolhydraten (suikers)




  • polysacchariden, enk. of samengest.

  • gebonden met andere soorten moleculen (complexe)

slecht kleurbaar met HE

voorzorgen fixeren: kleurbaar met kationische kleurstoffen

metachromasie (kenmerkend voor kraakbeen en mastcellen)

koolhydraten: lossen op in waterig fixatief =>gedeeltelijk verloren bij dehydratatie

dit verhinderen: stof bij fixatief: neerslag koolhydraten kleurbaar met kationische kleurstof  kleuromslag v/d kleurstof (dichte schikking – groepen)


  1. lipiden (vetten)




  • vetzuren: CnH2n+1 COOH

  • vetten lossen op in alcohol

  • weinig kleurbaar bij routine doorwerking

  • voor EM: OsO4 : grote affiniteit voor vetzuurketens: visualiseerbaar (fixatie: bewaard en gecontrasteerd)

  • structuren die veel vet bevatten (myeline, vetcellen)  lege zones op LM coupes


figuur 2 p. 13: LM-coupe kraakbeencel

donkere zone: blauwe kleurstof

iets lichtere zone: paarse kleurstof (toluidineblauw)

lege witte zones: vet

metachromatisch bindweefsel (kleuromslag) LM => HE (H -/ E +)
---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

contrasteren: EM

=> zonder kleuren, geen rechtstreeks beeld



  • elektronen worden versneld (1 golflengte): geen kleur

  • golflengte buiten bereik van gevoeligheid menselijk oog

fluorescentiescherm, beeld wordt op fotografische plaat gevormd (zwart-wit beeld)

  • cfr. LM: biologisch mat. vertoont weinig densiteitverschillen

  • contrasteren = verhogen densiteitverschillen

  • gebeurt met ZWARE METALEN (ipv HE bij LM)


OsO4 (osmiumtetraoxide): osmium = zwaar metaal

    1. bewaren van vetstructuren in membranen (grote affiniteit ervoor)

    2. contrast vergroten (grotere vergrotingen)

OsO4

reeds bij fixatief (affiniteit voor membranen)



  1. uranylacetaat: reageert met fosfaat en aminogroepen: NZ (nucleïnezuren) en eiwitten

  2. loodcitraat: reageert met negatieve groepen: NZ

I + II = CONTRASTERINGSVLOEISTOF
resultaat: structuren met deze metalen: donker: metalen zorgen voor ‘scatter’ v/d elektronen (dragen niet bij tot beeldvorming!)

beeldvorming EM: fotografische plaat (negatief)

structuren met


  1. zware metalen: geen elektronen doorlaten

  2. geen zware metalen: elektronen doorlaten => belichting negatief (zwart)

op het positief: omgekeerd beeld

figuur 3 p. 17: TEM

transmissie elektronen microscopie (elektronen door weefsel : 60-70 nm)
specifieke kleurtechnieken
indifferente kleurstoffen: kleuren vetten aan

(!) immunohistochemische kleuring (LM/ EM): kleuren specifieke bestanddelen: basis = antigen/antilichaambinding (antilichaam + kleurstof, fluorescente label of colloidaal goud)

enzymkleuringen: activiteit enzymen: gebruik voor enzym specifiek substraat => vorming waarneembaar neerslag

autoradiografie:histologische techniek metabolische activiteit visualiseren: radioactief gemerkte precursoren ingebouwd, coupes maken, contact met fotografische emulsie


figuur 4 p. 19 (EXAMEN!!): immunohistochemische kleuring
cel heeft cytoskelet: opgebouwd uit actine (stevigheid cel) (met gewone HE: geen details!)

sleutelslot principe:

lymfocyten maken antilichamen: antilichaam (lichaamsstof) past op antigen (lichaamsvreemde stof): directe binding => complex (antigen onschadelijk) => complex + visualiserende component (kleuring) om te weten waar in het weefsel zich het complex bevindt.

weefselcoupe


weefselstukje: actine (antigen)
kleuring met oplossing die antilichamen bevat

complex antilichaam visualiserende component (kleuring)



antigen
fluorescein ferritin

in de pathologie: bv. behandeling van een tumor => 1st identificeren oorsprong van de tumor (waar ergens in weefsel gesitueerd)


observatie LM
beeldvorming: glazen lenzen

vergroting: product van oculair (10x) en objectieflens (4,10,40,100x): max. 1000x

scheidend vermogen

  • kleinste afstand tussen 2 beelden die nog net te onderscheiden zijn van elkaar

  • bepaald door NA, kwaliteit van de lenzen

  • 0.61 / NA

: golflengte wit licht: 550 nm NA (numerieke apertuur) n x sin (sin max. 1: : 90°)

n: brekingsindex medium : helft tophoek lichtkegel



scheidend vermogen: 250 nm
observatie EM (zeer gedetailleerd)
beeldvorming:magneetspoelen

vergroting: tot 600000 en meer

scheidend vermogen:

  • 0.61 / NA

  • = 1.22 / hoogspanning nm (hoogspanning bv. 100000 volt)

scheidend vermogen: 3 nm
80-120 kV (hogere versnelling, meer licht)

80 wordt meest gebruikt: minder licht, maar bescherming van het weefsel, toch voldoende contrast


speciale observatiemethoden


  1. faze - contrast microscoop

  2. fluorescentie - microscoop

  3. confocale microscoop (virtuele sectie: 1 vlak)

  4. SEM: scanning elektronen microscoop  oppervlakken van cellen screenen TEM )

DEEL 2: cytologie: studie van de cel


cytomorfologie: beschrijving subcellulaire structuren (organellen) en functies

LM: membraan, kern, cytoplasma

(transmissie) EM: membraan, kern cytoplasma, mitochondriën, cytomembraneus systeem, cytosomen, cytofilamenteus systeem

cel: membraan + protoplasma (kern + cytoplasma)
gegeneraliseerde cel: alle organellen worden beschreven

  1. algemene functies: deling, metabolisme, beweging, celdood

  2. specifieke functie: secretie, contractie, celdifferentiatie…

=> organellen kunnen structureel beschreven worden door EM (ultrastructuur) niet door LM (onvoldoende resolutie)!

LM: enkel idee krijgen over organellen via kleuring (vitaal, immuun, enzym…)


figuur 5 p. 26: bloeduitstrijkje (HE) => bloedcellen onder LM

RBC


WBC (witte bloedcel): kern + cytoplasma (geen structuurdetails) beeldvorming bij LM: coupes kan, maar niet noodzakelijk

figuur 6 p. 27: WBC onder EM (details!)

coupes nodig (orde nm ipv 10 m = orde diameter v/e cel) voor goede beeldvorming



celorganellen
celmembraan
elke cel omgeven door membraan: unit membraan

functie:

  • integriteit (stevigheid) en flexibiliteit (soepelheid, bewegelijk)

  • selectieve barrière (laat bepaalde stoffen wel, andere niet door bv. antigen)

  • transport van stoffen

  • herkenning stoffen, cellen (signalisatie)

LM:fijne aflijning

EM: trilamellaire structuur: 2 donkere dense lagen en ertss. een lichte transculente (doorzichtige) laag (7nm)
structuur en samenstelling: (alle membranen zelfde basisstructuur)

  1. dubbele laag fosfolipiden = structuurbestanddelen

  2. lange hydrofobe staarten naar elkaar gericht

  3. hydrofiel kopgedeelten naar buiten (extra) en naar cytoplasma (intra)

  4. eiwitten: integraal = volledige membraan overspannend

perifeer = aan het oppervlak voorkomend (cytosolische of exoplasmatisch)

fluid mosaic model”



functies eiwitten: celadhesie, receptorfct., transport moleculen, verankering in cytoskelet, triggering intracellulaire signaal pathways…
figuur 7 p. 31: EM beeld v/d membranen van 2 naast elkaar gelegen cellen

 trilamellaire structuur, vaste afstand tss 2 cellen (intra-of extra cellulaire ruimte)

 karakteristieke beeld van unit-membraan in EM opnames: vooral bepaald door

OsO4 (fixatief en contrasteringscomponent)


  • hoge affiniteit apolaire ketens v/d fosfolipiden

  • dense (donkere) kleuring membraan


mitochondriën
structuur:

  • langwerpige organellen (0.5 /1 m dik en tot 10m lang)

  • LM: janusgroen

  • EM: 2 membranen:

    1. glad buitenmembraan

    2. binnenmembraan met kammen of cristae met elementaire partikels = ATP-osomen = F0 / F1 partikels

    3. 2 compartimenten:

biologische processen: ENERGIE (synthese eiwitten, NZ, actief transport moleculen tegen concentratiegradiënt in, spiercontractie…)



mitochondriën = energiecentrale cel

  • ATP onder aërobe omstandigheden (oxidatie glucose en vetzuren) genereren en opslaan

  • aantal en vorm aangepast aan energiebehoeften cel (bv. cristae = plooien : vergroten van het oppervlak  meer energie!)

functie:

  • synthese en stapelen ATP

  • proces: oxidatieve fosforylering / cellulaire ademhaling

  • buitenmembraan: porines = trimere (3-delig) transmembraanproteïnen die poriën in membraan maken => membraan permeabel voor moleculen tot 10000kD

  • binnenmembraan:

    • minder permeabel

    • 75 ´% eiwitten

    • transporteiwitten voor pyruvaat, vetzuren, ATP, ADP en organisch fosfaat

    • F0 / F1 complexen

    • e-transporteiwitten

matrix gericht: membraan bevat proteïne-complexen voor e-transport en ATP synthese

  • matrix:

  • oxidatie-enzymen voor pyruvaat

  • catabolisme vetzuren (afbraakstofwisseling = dissimilatie, samengestelde verbindingen vallen uiteen waarbij energie vrijkomt)

  • circulaire DNA molecule => autonomie matrix (DNA afkomstig van moeder => mitochondriën en embryo afkomstig van eicel)


ATP synthase4: 2 multiproteïne complexen: F0 / F1

    • beiden bestaan uit  subeenheden

    • geheel complex: peervormige structuren op binnenmembraan mitochondria (EM opname)

    • ATP-osomen


intern cytoplasmatisch membraansysteem

      • 3D systeem van membraangebonden zak- en buisvormige structuren (= cisternae)

      • geheel: synthese organische componenten (macromoleculen)

=> onderscheiden compartimenten: synthese eiwitten (membraan, secretie), lipiden en suikers

      • endoplasmatisch reticulum: RER (eiwitsynthese) & GER (kataboliseren suikers)

      • golgi-apparaat ( afwerkingsorganel: modifieert gesynthetiseerde eiwitten,sorteert eiwitten voor secretie / opbouw cel zelf oa membraaneiwitten)


ruw endoplasmatisch reticulum (RER)

sluit aan op kern!



  • RER : membranen (netwerk platte zakken = cisternen) waaraan ribosomen (korrelig) gebonden zijn langs de cytosol zijde

  • ribosomen: samenstelling eiwitten en rRNA (blauwe korreling in cytosol na HE kleuring)

  • LM: Nissl-basofiele korrels in cytoplasma (blauw door H!)

  • EM: 2 subeenheden: grote en kleine (ook niet – gebonden, vrij = cytoplasmatisch => eiwitsynthese!)


synthese van delen van 1 polypeptideketen simultaan

=> ribosomen dicht bij elkaar op zelfde RNA-keten



polyribosomen = clusters ribosomen op 1 enkele mRNA-streng


  1   2   3   4   5   6


De database wordt beschermd door het auteursrecht ©opleid.info 2017
stuur bericht

    Hoofdpagina