Één getal worden ingevuld. Rond pas aan het eind van de berekening af



Dovnload 31.62 Kb.
Datum30.09.2016
Grootte31.62 Kb.
Toets Biologische Chemie Biochemiedeel (BIC 10304), 1 maart 2007
Begin met het invullen van je naam en registratienummer op het antwoordfor­mulier. De eerste tien vragen dienen met juist/on­juist beantwoord te worden. Bij de resterende vier vragen moet één getal worden ingevuld. Rond pas aan het eind van de berekening af.
Algemene opmerking: bij de extinctiemetingen is steeds gebruik gemaakt van cuvetten met een lichtweg van 1 cm. Veel succes!
1. Men heeft lactaat dehydrogenase met behulp van het programma Swiss PDB viewer bestudeerd. Men kijkt naar een computersimulatie. In de simulatie wordt op basis van aminozuurvolgorde van lactaat dehydrogenase een structuur berekend en met een kleur wordt aangegeven welk soort atoom het betreft. Rood is zuurstof, blauw is stikstof enz.
2. Bij de in vivo fluorescentie meting van gistcellen wordt de fluorescentie van NADH gemeten. Veranderingen in de NADH concentratie worden veroorzaakt door een wisselende activiteit van de enzymen van ondermeer de glycolyse.
3. Om een zuurstofelectrode te ijken is het voldoende als men de temperatuur en luchtdruk weet.
4. Een epitoop is een deel van een (macro)molecuul waaraan een IgG molecuul bindt.
5. Als bij een extinctiemeting 50% van de lichtintensiteit van de lichtbundel geabsorbeerd wordt, meet men een extinctie van 0.301 (= c). De wet van Lambert-Beer is: log(Ibl/Im) = c.
6. Bij het uitrekenen van de bindingsconstante van NADH aan LDH besluit een 'slimme' student de laatste waarde van de titratie te gebruiken om de relatie fluorescentie-concentratie van het NADH-LDH complex uit te rekenen. Zijn redenatie is dat visueel gezien de fluorescentie min of meer constant is bij toenemende LDH concentraties. Is dit een slimme student, ja (juist) of nee (onjuist)?
7. De GPT activiteit wordt gemeten door de NADH oxidatie door pyruvaat te volgen met alanine en α ketoglutaraat.

alanine + α ketoglutaraat (GPT) pyruvaat + glutamaat

pyruvaat + NADH (LDH) lactaat + NAD+.

De GPT meting is uitgevoerd met 5 units lactaat dehydrogenase en er wordt berekend dat er 5 units GPT in het cuvet aanwezig moeten zijn geweest. Geeft de uitkomst van de activiteitsbepaling van GPT een juiste serumwaarde of niet?


8. De pKa van de restgroep van histidine in LDH wordt verlaagd omdat er een aspartaatresidu (negatief geladen) in de nabijheid aanwezig is. De zijketen van histidine is een basische groep en die van aspartaat een zure groep.
9. In een isoelectrisch focuseringsexperiment wordt in de prefocuseringsfase met behulp van een electrische spanning de gel op temperatuur gebracht. Nadat er een stabiele temperatuur verkregen is, worden de eiwitten via de sample applicator opgebracht en van elkaar gescheiden op basis van verschillen in pH.
10. Uit de cuvettenhouder van een fluorimeter heeft een ‘sloperige’ student de filters gehaald. De assistent heeft aan de student gevraagd de filters terug te plaatsen. Hij plaatst het filter dat licht boven de 406 nm doorlaat aan de kant van de monochromator en het filter dat licht tussen 300 en 400 nm doorlaat aan de kant van de fotomultiplier. Gaat de meting lukken (vakje zwart maken) of niet (niets doen)?

11. De activiteit van lactaat dehydrogenase is gemeten. De resultaten van deze meting staan op de recorderrol. De volgende toevoegingen zijn gedaan. 1 ml fosfaatbuffer (Pi), 0.01 ml 10 mM oxamaat. Met set ref is de uitlezing van de spectrofotometer op nul gezet. 0.01 ml 10 mM NADH is toegevoegd, daarna is 0.01 ml 0.25 mg/ml LDH toegevoegd. Nog steeds geen activiteit. Na het toevoegen van 0.01 ml 10 mM pyruvaat wordt er een afname van de NADH concentratie waargenomen. Let op het volume van het cuvet is geen 1 ml. De raaklijn aan de curve is reeds getrokken.

De recorderuitslag van 0 naar 100 komt overeen met een extinctieverschil van 1.0. De afstand tussen de getrokken lijnen op het recorderpapier komt overeen met 1 minuut. Dit is de afstand tussen twee lijnen die op afstanden van 1 min van links naar rechts op het papier geprint zijn (het figuur is verkleind ten opzichte van de echte recorderrol, gebruik dus het figuur en geen centimeter om de activiteit uit te rekenen). De molaire extinctie coëfficiënt van NADH is 6300 M-1.cm-1.
Bereken de activiteit van LDH in mol. s-1. mg LDH-1 onder bovenstaande condities.
12. De activiteit van het reporterenzym ß-glucuronidase wordt in een transgene plant gemeten. Het enzym katalyseert (o.a.) de volgende omzetting:
4-methylumbelliferyl-ß-D-glucuronide + H2O 4-methylumbelliferon + D-glucuronzuur
Onder de gegeven proefomstandigheden (pH=8.5) is 4-methylumbelliferon de enige stof in bovenstaande reactievergelijking, die fluorescentie vertoont.


  • Het extract is gemaakt door 15 mg plantmateriaal fijn te wrijven in extractiebuffer. Het extract had een volume van 200 μl.

  • Het toevoegen van 10 μl van het extract aan reactiebuffer met 0.5 mM MUG (het volume was 1.1 ml), leidde tot een uitslag van 37 schaaldelen in 3 minuten.

  • Om de juiste waarde aan de fluorescentie te kunnen toekennen, werd de fluorescentie van een 4-methylumbelliferon (MUB) oplossing bepaald. 25 μl van een 10 μM MUB oplossing werd toegevoegd aan reactiebuffer met 10 µl extract. Het volume werd door de MUB toevoeging 1.25 ml. Deze toevoeging gaf een uitslag van 42 schaaldelen. Het bladextract quenchte de fluorescentie niet.

  • Eén pmol=10-12 mol.


Bereken de specifieke enzymactiviteit uitgedrukt in pmol.min-1.mg plantmate­riaal -1.

13) Met behulp van een zuurstofelectrode is een kwantitatieve urinezuurbepaling uitgevoerd volgens de onderstaande reacties:

urinezuur + 2H2O + 02 (uricase) allantoine + H202 + 2CO2.

H202 + CH3OH (katalase) 2H20 + CH2O.



CH2O + 2 acetylaceton + NH3 3,5 diacetyl-1,4-dihydrolutidine (DDL) + 3 H2O

Men had in het oxygraafvaatje het onderstaande gepipetteerd:

Urinezuurbepalingsmengsel (bevat o.m. katalase) 2.5 mL

Urine (onverdund) 0.3 mL


De zuurstofconcentratie wordt gedurende 5 minuten gevolgd. Daarna wordt 0.05 mL uricase (1 mg/mL) door de dop toegevoegd. Het volume is nu 2.85 mL. Nadat de zuurstofafname snelheid weer stabiel geworden was, is via een extrapolatie bepaald dat de zuurstofafname door het toevoegen van uricase 38 schaaldelen was. De calibratie van de zuurstofelectrode gaf voor een oplossing van 230 M O2 90 schaaldelen aan.
Welke is de concentratie urinezuur (in mM) in de onverdunde urine?



  1. De bindingsconstante van NADH aan LDH is met behulp van fluorescentie bepaald. Uit de grafiek van de fluorescentietoename tegen de toegevoegde LDH wordt een maximale fluorescentie van 398 geschat. Wanneer 2.136 M LDH was toegevoegd was de fluorescentietoename 185. De NADH concentratie was in de metingen steeds 4 M.

De dissociatieconstante van het LDH-NADH complex is:
Kd = ([LDH]vrij*[NADH]vrij)/[LDH-NADH]complex
Bereken uit de bovenstaande gegevens de Kd.
Antwoordenformulier Toets Biologische Chemie Biochemie deel 1 maart 2007
Naam :

Registratienummer :

Handtekening :

Maak per vraag slechts één vakje zwart! Als je je antwoord wilt toelichten mag dat. Je toelichting wordt meegewogen in de beoordeling van je antwoord.

1) O juist O onjuist
2) O juist O onjuist
3) O juist O onjuist
4) O juist O onjuist
5) O juist O onjuist
6) O juist O onjuist
7) O juist O onjuist
8) O juist O onjuist
9) O juist O onjuist
10) O juist O onjuist

11) De activiteit van LDH is mol . s-1. mg LDH-1

12) De GUS activiteit is pmol.min-1.mg plantmate­riaal -1.

13) De concentratie urinezuur in de onverdunde urine is mM (let op de eenheid)


14) De KD is µM


Uitwerking: Toets Biologische Chemie Biochemiedeel (BIC 10304), 1 maart 2007
1) Onjuist. Op basis van de verstrooiing van een X-ray bundel wordt de electronendichtheid berekend en kan aan het aantal electronen rondom een kerm bepaald worden welk atoom het betreft. De ruimtelijke oriëntatie van de atomen in het kristal worden op het scherm gezet..

5) Juist 50% absorptie dus 50% doorgelaten. Deze hoeveelheid licht wordt vergeleken met de 100% = blanco waarde. 1/0.5 = 2.0; log2.0 = 0.301.

6) Onjuist. Pas bij een oneindige concentratie is alle NADH gebonden. Dus altijd een waarde iets boven de laatste waarde kiezen en dan de waarde variëren om voor elk punt van de bindingscurve eenzelfde berekende KD te krijgen.

7) Je meet eenzelfde activiteit van de activiteit van het detectie-enzym. Als de GPT activiteit groter is, zal je het niet registeren omdat het detectie-enzym niet sneller is. Dus geen goede meting.

8) Onjuist. De pKa wordt verhoogd. De positief geladen vorm van histidine wordt gestabiliseerd.. Om de H+ eraf te krijgen moet je de H+ concentratie verlagen dus de pH verhogen. De pKa neemt dus toe.

9) Onjuist. In de prefocuseringsfase met behulp van een electrische spanning een pH gradiënt in de gel gevormd.

10) Onjuist. Eerst laat je licht door waarmee je moleculen aanslaat (lichtabsorptie) en vervolgens meet je bij een grotere golflengte de fluorescentie.
11) (0.75/6.3) x 1.04 (mol/min) x 1/60 x 1/(0.01 x 0.25) = 0.825 mol/s/mg
12) (25 µL x 10 µM)/1250 µL = 0.2 µM = 200 nM. Deze concentratie geeft 42 sd. 1 sd = 4.762 nM. (37 x 4.762 (nM) x 1.1 (mL))/3 (min)= 64.603 pmol/min. Dit wordt veroorzaakt door 10 x 15/200 = 0.75 mg plantmateriaal.

per mg plantmateriaal wordt de activiteit 64.603/0.75 = 86.138 pmol/min/mg plant.




  1. 38/90 x 230 (µM) x 2.85 (mL) = 276.767 nmol afkomst uit 0.3 mL urine. Per mL onverdund dus 276.767/0.3 = 922.556 µM = 0.923 mM.

14) De concentratie complex is 185/398 x 4 µM = 1.859 µM. De KD wordt dan



(2.136 – 1.859) x (4 – 1.859) / 1.859 = 0.319 µM
Berekening cijfer: voor elke juist/onjuist vraag 2 punten (gokscore 1 punt), voor elke zevenkeuze vraag 6 punten (geen goks­core).
Maximaal aantal punten is 44, gokscore is 10 punten.
cijfer = ((punten-10)/(44-10))*9 + 1
5.5 is voldoende.



De database wordt beschermd door het auteursrecht ©opleid.info 2017
stuur bericht

    Hoofdpagina