Ontzouten van een aminozuurmengsel met een ionenwisselaar



Dovnload 5.8 Kb.
Datum23.08.2016
Grootte5.8 Kb.
Ontzouten van een aminozuurmengsel met een ionenwisselaar.

Dit voorschrift is bijna ongewijzigd overgenomen uit het in 1967 door de afdeling onder leiding van M.G.J.Buys geschreven handboek:

Aminozuur Analysator.
Bij het ontzouten van een aminozuurmengsel met een ionenwisselaar worden behalve zouten ook eiwitten, peptiden, lipiden en stoffen met aldehyde en ketongroepen verwijderd; waardoor een zuiver en goed te analyseren monster ontstaat. Nadeel is dat NH3 niet meer te bepalen is (door opname uit de lucht toch al moeilijk te bepalen).
Als ionenwisselaar wordt een sulfonzure hars gebruikt in de H+-vorm; bv. DowexX8, 20-50 mesh. Omdat de hars normaal altijd verontreinigd is met allerlei storende componenten, moet deze eerst grondig gereinigd worden. De hars wordt daarvoor met 2N NaOH gewassen door oproeren en decanteren; dit wordt herhaalde tot de de NaOH niet meer geel kleurt. Nu wordt 5x het volume van de hars aan 2N NaOH toegevoegd aan de hars, en onder regelmatig roeren (niet met een magneetroerder) één uur op 100oC verwarmd. De hars wordt nu op een glazen G3-filter gebracht en achtereenvolgens gewassen met (zorg dat er geen lucht tussen de harspartikels komt):


  1. gedestilleerd water tot neutrale pH (minstens een half uur)

  2. 4N zoutzuur P.A. gedurende minstens één uur.

  3. gedestilleerd water tot neutrale pH (minstens een half uur).

Tenslotte wordt de hars drooggezogen en met aanhangend water onder afsluiting van lucht in de koelkast opgeslagen. De zo verkregen hars is enkele weken houdbaar.
Een monster van maximaal 10mg(circa 50μmol) aan aminozuren, met een volume van circa 1 ml en een pH die tussen 1 en 7 ligt wordt in een reageerbuisje gedaan (eventueel norvaline of norleucine toevoegen als interne standaard). Voeg nu zoveel hars toe dat de verhouding harsbezinksel/bovenstaande vloeistof 1:1 is. De buis wordt afgesloten en 30 minuten krachtig geschud. Hierna wordt de pH gemeten door een klein druppeltje op een pH-papiertje te brengen; de pH moet lager zijn dan 2. Indien dit niet het geval is nogmaals éénzelfde hoeveelheid hars toevoegen en 30 minuten krachtig schudden. De bovenstaande vloeistof bevat het niet-geïoniseerde materiaal (suikers,e.d.), grote eiwitbrokken en de anionen. Met een klein pipetje wordt de bovenstaande vloeistof onder de hars weggezogen. De hars wordt gewassen door aqua bidest toe te voegen tot het oorspronkelijke volume en 15 minuten te schudden. Hierna wordt de wasvloeistof onder de hars uitgezogen. Deze wassing wordt nog een keer herhaald.

De aminozuren worden van de hars geëlueerd met 5N ammonia, die 0,5% thiodiglycol bevat(anti-oxidans). Er wordt ammonia toegevoegd tot het oorspronkelijke volume en 30 minuten geschud. Het ammonia-eluaat wordt overgebracht met een pasteurs-pipetje in een puntkolfje; controleer of het naar ammonia ruikt, indien niet: elutie herhalen. De elutie-procedure 2x herhalen met 15 minuten schudden.



Het puntkolfje wordt droogedampt onder hoogvacuüm met een roterende verdamper bij maximaal 35oC. Hierna 2x circa 1 ml water toevoegen en weer droogdampen om de overtollige ammonia te verwijderen. Zo drooggedampt zijn de monsters onder goede afsluiting goed in de koelkast te bewaren.

Versturen van monsters in droge toestand in een epje of HPLC-vaatje (laatste keer droog dampen in epje of HPLC-vaatje).




De database wordt beschermd door het auteursrecht ©opleid.info 2019
stuur bericht

    Hoofdpagina