Practicum Microbiologie Inhoudsopgave



Dovnload 149.96 Kb.
Datum25.08.2016
Grootte149.96 Kb.
Practicum Microbiologie




Inhoudsopgave:


1. Inleiding. 4

2. Gehakt of gemalen vlees. 6

2.1 Inleiding 6

2.2. Aëroob koloniegetal 6

2.2.1 Inleiding. 6

2.2.2 Benodigdheden: 6

2.2.3 Bereiding PCA 6

2.2.4 Werkwijze 7

2.3. Aanwezigheid van Salmonella 7

2.3.1 Inleiding. 7

2.3.2 Benodigdheden: 9

2.3.3 Bereidingen: 9

2.3.3.1 Buffered Pepton Water (handelspreparaat van OXOID) 9

2.3.3.2 Rappaport Vassiliades Broth (handelspreparaat van OXOID) 9

2.3.3.4 Brillant Green Agar met Sulphamandelate (handelspreparaat van OXOID) 10

2.3.3.5 Bereiding Triple Sugar agar op schuine buis (handelspreparaat van Oxoid) 10

2.3.4 Werkwijze 10

2.3.4.1 Resuscitatie 10

2.3.4.2 Ophoping 10

2.3.4.3 Isolatie 11

2.3.4.4 Bevestiging 12

2.4 Aanwezigheid van Staphylococcus aureus 15

2.4.1 Inleiding 15

2.4.2 Benodigdheden 16

2.4.3 Bereidingen 17

2.4.3.1 Cultuurbuizen gevuld met Giolotti Cantoni Broth 17

2.4.3.2 Basis Baird-Parkeragar 17

2.4.3.3 Baird-Parkeragar met eidooieremulsie 17

2.4.3.3 Baird-Parkeragar met konijnenbloedplasma 17

2.4.4 Werkwijze 18

2.4.4.1 Ophoping 18

2.4.4.2 Isolatie en bevestiging 18

3. Rauwkostsalade 19

3.1 Inleiding 19

3.2 Aëroob koloniegetal 19

3.2.1 Inleiding (zie 2.2.1) 19

3.2.2 Benodigdheden (zie 2.2.2) 19

3.2.3 Bereiding PCA (zie 2.2.3) 19

3.2.4 Werkwijze 19

3.3 E coli en Coli-achtigen 21

3.3.1 Inleiding 21

3.3.2 Benodigdheden 21

3.3.3 Bereiding Brillant Green Bile Broth (= Briljantgroen Gal bouillon) op dubbele sterkte. 21

3.3.4 Werkwijze 22

3.4 Lactobacillen 22

3.4.1 Inleiding 22

3.4.2 Benodigdheden 22

3.4.3 Bereiding Rogosa agar 23

3.4.4 Werkwijze 23

4. Tompouce 24

4.1 Inleiding 24

4.2 Telling en identificatie van Enterobacteriaceae. 24

4.2.1 Inleiding 24

4.2.2 Benodigdheden: 24

4.2.3 Bereiding VRBG agar 25

4.2.4 Werkwijze 25

4.3 Telling van Bacillus cereus 26

4.3.1 Inleiding 26

4.3.2 Benodigdheden 26

4.3.3 Bereiding Bacillus cereus selective agar base (met toevoegingen van eidooier en Polymyxine) 27

4.3.4 Werkwijze 27

4.4 Telling van het aantal gisten. 27

4.4.1 Inleiding 27

4.4.2 Benodigdheden 28

4.4.3 Bereiding Oxytetracycline Yeast extract Glucose Agar (OGYE) 28

4.4.4 Werkwijze 28

Bijlage 1: Kleuring van Bacteriën. 29

A. METHYLEENBLAUW-KLEURING (niet bij dit practicum) 30

B. GRAM-KLEURING 30

Bijlage 2 De entero tube 33

Bijlage 3: Isolatie en zuivering 34

Bijlage 4. Uitvoering katalase test 35



Bijlage 5. Planning en materiaal

1. Inleiding.

Tijdens dit practicum zullen drie verschillende voedingsmiddelen microbiologisch worden onderzocht.

Elke week zullen we een nieuw voedingsmiddel gaan onderzoeken.

De volgende producten zullen worden onderzocht:




Product

Onderzoek op

Soort onderzoek


Rauw gemalen vlees

Aëroob koloniegetal

Telling

Salmonella

Aanwezigheid in 25 gram en bevestiging

Staphylococcus aureus

Aanwezigheid in 1 gram en bevestiging aanwezigheid coagulase positieven

Rauwkostsalade

Aëroob koloniegetal

Telling

Coli achtigen

Aanwezigheid in 1 gram

Lactobacillen

Telling en bevestiging

Tompouce

Enterobacteriaceae

Telling en identificatie

Bacillus cereus

Telling volgens strijkplaatmethode

Gisten

Telling

Helaas zullen de experimenten niet telkens alleen tijdens de officiële practicum uren kunnen plaatsvinden maar zullen hiernaast ook tijdens de andere dagen werkzaamheden verricht dienen te worden. (zoals b.v. overenten, tellen, beoordelingen etc)

Iedere deelnemer aan het practicum dient individueel een verslag te maken. Om het verslag een echt verslag te laten zijn zal men tijdens dit practicum een lab journaal moeten bijhouden met waarin de afwijkingen en de resultaten en waarnemingen worden weergegeven. Een eenvoudig schriftje voldoet hiervoor prima.

Aangezien tijdens dit practicum allerlei bacteriën worden opgekweekt die in meer of mindere mate ernstige ziektes kunnen veroorzaken is het van groot belang de volgende veiligheidsmaatregelen in acht te nemen.



  1. Niet eten, drinken en roken tijdens het practicum.

  2. Voorafgaand aan en na afloop van het practicum de handen goed wassen met desinfecterende zeep. Dus ook bij het tussentijds pauzeren!

  3. Alle gebruikte media worden verzameld en d.m.v. sterilisatie onschadelijk gemaakt.
    Niet niets in de gootsteen of open op de tafels laten staan)

2. Gehakt of gemalen vlees.

2.1 Inleiding


We zullen gehakt of gemalen vlees onderzoeken op het aëroob koloniegetal, de aanwezigheid van Staphylococcus aureus en de aanwezigheid van Salmonella’s.

2.2. Aëroob koloniegetal

2.2.1 Inleiding.


Onder het Aëroob koloniegetal wordt verstaan het aantal kolonies dat zich ontwikkeld uit een 1 gram of 1 ml van een voedingsmiddel op Plate Count Agar, TSBYA agar of All Purpose Tween Agar (APT) , na bebroeding gedurende 72 uur bij 30 °C. Tijdens dit practicum gebruiken wij PCA (Plate Count Agar). Dit is een medium waarop een zeer brede variatie aan micro-organismen tot ontwikkeling kan komen. Indien nodig kan hier nog extra ondermelk als voedingstof worden bijgevoegd.

Indien de flora echter uit micro-organismen bestaat die zeer strenge eisen stelt aan het medium kan in bijzondere gevallen de voorkeur worden gegeven aan TSBYA of APT agar.


2.2.2 Benodigdheden:


  • PCA agar (handelspreparaat van OXOID)

  • Petrischalen (doorsnee 9 cm)

  • Verdunningsvloeistof: Pepton Fysiologische Zout oplossing (PFZ) in reageerbuizen met dop voor het maken van decimale verdunningen.

  • Steriele 1 ml pipetten

2.2.3 Bereiding PCA


Los onder verwarming het handelspreparaat op in gedestilleerd water.

(17,5 gram toevoegen aan 1 liter gedestilleerd water)

Steriliseer m.b.v. een autoclaaf gedurende 15 minuten bij 121°C.

2.2.4 Werkwijze


Alvorens een hoeveelheid monster uit de verpakking kan worden gehaald dient deze aan de buitenzijde volledig gedesinfecteerd te worden. Besproei de buitenzijde van de verpakking met 70% alcohol. Open de verpakking aan één zijde voorzichtig met een uitgegloeide (dus steriele) schaar. Gloei een pincet uit. En laat de pincet afkoelen in alcohol en brandt de pincet voorzichtig af. Breng 20 gram van de inhoud over in een Stomacherzak. Voeg vervolgens 180 ml steriele PFZ oplossing toe. Meng het geheel m.b.v. de Stomacher.

(na het openen van de verpakking moeten ook de monsters voor de andere bepalingen worden genomen)

Zorg dat de benodigdheden hiervoor klaar staan op tafel!

Pipetteer op aseptische wijze 1 ml van het gemengde geheel en breng deze over in een buis gevuld met 9 ml steriele PFZ-oplossing. Verdun verder op de gebruikelijke wijze.

Kies de in te zetten verdunning zodanig dat tenminste één van de verdunningen een aantal kolononies oplevert dat tussen de 30 en de 300 ligt.

Gebruik voor elke decimale verdunning 2 petrischalen. Pipetteer in elk van deze petrischalen 1 ml van het verdunde product.

Voeg ca 10 tot 15 ml PCA van 48 °C toe aan elke petrischaal. Meng vervolgens door de plaat voorzichtig in achtvorm over de tafel te schuiven. Let er hierbij op dat de agar niet de deksel raakt.

Bebroed de platen met de agarbodem omhoog gedurende 72 +/- 3 uur bij 30°C +/- 1°C. (Dit valt bij ons practicum in het weekend. Daarom moeten we na 2 dagen en na 5 dagen tellen)


2.3. Aanwezigheid van Salmonella

2.3.1 Inleiding.


Salmonella is een gevreesde bacterie in voedsel. De meeste variëteiten veroorzaken in meer of mindere mate ernstige Gastro-enteritis (dit is een maagdarm infectie met de volgende verschijnselen: (soms) braken en (meestal hevige) diarree). Salmonella typhii echter veroorzaakt tyfus een ernstige ziekte, waarbij de bacteriën zich ook in de bloedbaan van het slachtoffer bevinden. Deze ziekte eindigt vaak met de dood.

In gehakt en kippenvlees komen regelmatig salmonella’s voor die aanleiding geven tot voedselinfecties. Het voorkomen hiervan is erg lastig omdat de keten (nog) niet volledig beheerst is.

Door enige vervelende voedselvergiftigingen (m.n. in het zuiden van het land) kwam men erachter dat Salmonella enteritides ook vanuit het darmkanaal van de kip het ei kon besmetten. Sindsdien is er door onderzoek en controle van de voedselketen naar gestreefd om de legkippen vrij van Salmonella enteritides te houden.

Salmonella wordt geacht aanwezig te zijn indien na voorbebroeding en ophoping van de voorgeschreven hoeveelheid monster op b.v. Rappaport Vassiliades Broth en isolatie van een kolonie op Briljant Groen Agar met daaraan toegevoegd Sulfa-mandelaat en vervolgens reagerend volgens een specifieke reactie op Triple Sugar Iron agar.

Bij onderzoek op Salmonella is het altijd gewenst om voorafgaand aan de eigenlijke ophoping een resuscitatie toe te passen. Deze resuscitatie is nodig om de mogelijk enigszins beschadigde of minder levensvatbare bacteriecellen enigszins op te peppen voordat deze blootgesteld worden aan de selectieve ophopingsmedia. In deze selectieve media zijn meestal remmende stoffen aanwezig die het te selecteren micro-organisme ook kunnen verhinderen om tot ontwikkeling te komen. Weliswaar wordt de overige microflora nog sterker geremd.

Een resuscitatie zorgt ervoor dat het te selecteren micro-organisme de selectieve ophoping beter doorstaat en beter uitgroeit.

De Selectiviteit van de Rappaport Vassiliadis ophopingsmedium berust op het feit dat Salmonella in staat is om bij een relatief hoge osmotische druk (veel zouten) en bij een hoge temperatuur (43°C) te groeien. Malachiet groen werkt als remstof voor de overige flora.

Na de ophoping moet worden afgestreken op Briljant Groen Agar waaraan Sulfa-mandelaat is toegevoegd. Briljant groen remt de Grampositieve bacteriën. De kolonies van Salmonella vergisten aminozuren, hierdoor verandert de kleur van de agar naar rood.

Concurrerende flora die wel de aanwezige suikers kunnen vergisten vormen zuur en hierdoor verandert de kleur in geel/groen.

Bevestiging van Salmonella wordt uitgevoerd door het beënten van Triple Sugar Agar op een schuine buis. Door met een entnaald een streep op het oppervlak en een steek naar de bodem aan te brengen kan men zowel de groei onder aërobe als ook onder anaërobe omstandigheden beoordelen. Salmonella vertoont het volgende beeld:

Voet : Geel vergezeld van zwartkleuring

Enige bellen of scheuren als gevolg van gasvorming

Oppervlak: Roodkleuring

2.3.2 Benodigdheden:


  • Buffered Pepton Water (handelspreparaat van OXOID)

  • Erlenmeyer 500 ml

  • Rappaport Vassiliades Broth (handelspreparaat van OXOID)

  • Brillant Green Agar (handelspreparaat van OXOID) met Sulphamandelate supplement

  • Petrischalen (doorsnee 9 cm)

  • Triple sugar Agar (handelspreparaat van OXOID)

  • Steriele pipet van 25 ml

  • Steriele pipet van 1 ml

  • Steriele pipet van 5 ml

  • Cultuurbuizen met dop



2.3.3 Bereidingen:

2.3.3.1 Buffered Pepton Water (handelspreparaat van OXOID)


Los 20 gram van het handelspreparaat op in 1 liter gedestilleerd water.

Verdeel de vloeistof over de uiteindelijke behouders in ons geval 250 ml erlenmeyers.

Steriliseer m.b.v. een autoclaaf gedurende 15 minuten bij 121°C.

2.3.3.2 Rappaport Vassiliades Broth (handelspreparaat van OXOID)


Voeg 30 gram van het droge handelspreparaat toe aan 1 liter gedestilleerd water. Verwarm zachtjes totdat alle ingrediënten volledig zijn opgelost. Verdeel de oplossing in porties van 10 ml over cultuurbuizen voorzien van dop.

Steriliseer de buizen m.b.v. een autoclaaf bij 115 °C gedurende 15 minuten.



2.3.3.4 Brillant Green Agar met Sulphamandelate (handelspreparaat van OXOID)


Suspendeer 26 gram van het handelspreparaat in 0,5 liter gedestilleerd water. Verhit voorzichtig tot aan het kookpunt om alle ingrediënten volledig op te lossen. Dit medium mag niet gesteriliseerd worden. Koel voorzichtig terug tot 50 – 55 °C.

Voeg hierna het sulphamandelate supplement toe. Dit supplement wordt verkregen door 5 ml gesteriliseerd gedestilleerd water toe te voegen aan een buisje met het droge preparaat. De inhoud van 1 buisje is voldoende voor 500 ml agar oplossing.

Giet vervolgens platen met de agar. Bewaar de petrischalen met de agar in de koeling (2-8°C).

2.3.3.5 Bereiding Triple Sugar agar op schuine buis (handelspreparaat van Oxoid)


Suspendeer 65 gram van het handelspreparaat in 1 liter gedestilleerd water. Breng dit mengsel onder goed roeren voorzichtig aan de kook om alles goed op te lossen. Verdeel de agar over cultuurbuizen voorzien van dop. Steriliseer m.b.v. een autoclaaf bij 121 °C gedurende 15 minuten. Laat de agar in de buizen stollen onder een licht hoek. De bedoeling is dat een schuine bovenoppervlak wordt gerealiseerd van ca 4 cm. Bewaar de gestolde bijzen in de koeling (2-8 °C).

2.3.4 Werkwijze

2.3.4.1 Resuscitatie


Breng vanuit de verpakking, die bij de vorige bepaling al is geopend 25 gram over in de kolf met de BPW m.b.v. een steriele pincet.

Meng op aseptische wijze 25 gram van het monster met 225 ml van het BPW. Bebroed dit mengsel gedurende 18 uur bij 37 °C +/- 1.


2.3.4.2 Ophoping


Vervolgens dient 0,1 ml van dit mengsel (BPW met monster) op aseptische wijze worden overgebracht naar 10 ml van de Rappaport Vassiliades Broth. Deze bouillon moet voor het overenten op een temperatuur van 43 °C zijn gebracht.

De bouillon moet vervolgens gedurende 2 dagen worden bebroed bij 43 °C +/- 0,5.


2.3.4.3 Isolatie


Na de eerste en de tweede dag moet vanuit de bouillon worden afgestreken op de Briljant Groen Agar met sulphamandelaat supplement. Dit afstrijken dient op de bekende wijze te geschieden.

De öse (entnaald) eerst uitgloeien. Vervolgens de öse afkoelen in alcohol en hierna de alcohol voorzichtig afbranden.

Voor het afstrijken ter zuivering wordt de volgende techniek aanbevolen: Tip met het oogje van de entnaald een bij voorkeur losliggende kolonie in het centrum aan. Bij het isoleren uit een bouillon (dit doen wij hier!) doop je het uitgegloeide en afgekoelde oogje van de entnaald in de bouillon.

Maak met het oog van de naald 4 of 5 evenwijdige dicht bij elkaar gelegen strepen aan één zijde van de plaat. (Zie 1 bij onderstaande figuur). Gloei de naald opnieuw uit en laat deze afkoelen (in alcohol en vervolgens de alcohol voorzichtig afbranden).

Maak hierna zonder nieuw bacteriemateriaal aan de naald te nemen opnieuw 4-5 strepen onder een hoek van ca 105° met de eerste serie zodanig dat deze worden gekruist. (Zie 2 bij onderstaande figuur). Herhaal deze handeling nog twee keer (zie 3 en 4 bij onderstaande figuur). Breng vervolgens een streek naar het centrum van de plaat. (Zie 5 bij onderstaande figuur). Gloei steeds de naald uit tussen de handelingen 2,3,4, en 5.

O
p deze wijze is de kans dat u losliggende kolonies verkrijgt groot.


Bebroed de platen bij 37 °C +/- 1 gedurende 18 tot 24 uur.

De door Salmonella gevormde kolonies worden omgeven door helderrood medium. Door andere bacteriën gevormde kolonies zullen een geelgroene kleur vertonen.


2.3.4.4 Bevestiging


Vanuit een kolonie met een helderrode hof overenten op Triple Sugar Agar in schuine buis. De wijze van enten is hierbij bijzonder.

De entnaald die hiervoor gebruikt dient te worden heeft een rechte naald met een enigszins platte punt.



1. Oppervlak beënten

2. Onderkant buis beënten

Zowel het oppervalk van de schuine buis als de onderkant van de buis moet beënt worden. Eerst dient een weinig bacteriemateriaal op de steriele naald te worden aangebracht.

Hierna met de punt van de naald een rechte streep op het oppervlak aanbrengen.

Van onderuit terug naar boven over het oppervlak van de schuine zijde. (Zie 1 in de bovenstaande figuur).

De naald vervolgens van bovenuit schuin naar beneden in de agar steken. (Zie 2 in de bovenstaande figuur).

Deze manier laat het toe zowel de groei onder aërobe als onder min of meer anaërobe omstandigheden te beoordelen. Ook eventuele gasvorming zal vastgesteld kunnen worden.

Beoordeel de buizen na 24 tot 48 uur bebroeding op 37 °C +/-1. Een gele verkleuring duidt op zuurvorming. Een basische reactie wordt zichtbaar door een rode verkleuring. Gasvorming is te herkenen aan gasbellen of scheuren in de agar. H2S vorming kan worden vastgesteld door de aanwezigheid van een zwarte verkleuring.

Hiervoor kan de volgende tabel op de volgende bladzijde worden gebruikt.



Beoordeel de groei in de TSA volgens de tabel. Geef aan met welk organisme het patroon overeenkomt.


Organisme

Onderkant van de buis Z(uurvorming) / G(asvorming)

Schuine kant (oppervlak) Z(uurvorming)

H2S vorming (zwartverkleuring)

Enterobacter aerogenes

Z + G

Z

Negatief

Enterobacter cloacae

Z + G

Z

Negatief

Escherichia coli

Z + G

Z

Negatief

Proteus vulgaris

Z + G

Z

Positief

Morganella morgianii

Z of Z + G

Geen verandering of Basisch

Negatief

Shigella dysenteriae

Z

Geen verandering of Basisch

Negatief

Shigella sonnei

Z

Geen verandering of Basisch

Negatief

Salmonella typhi

Z

Geen verandering of Basisch

Positief

Salmonella paratyphi

Z + G

Geen verandering of Basisch

Negatief

Salmonella enteritides

Z + G

Geen verandering of Basisch

Positief

Salmonella typhimurium

Z + G

Geen verandering of Basisch

Positief



2.4 Aanwezigheid van Staphylococcus aureus

2.4.1 Inleiding


Staphylococcus aureus is een gevreesde bacterie, die o.a. op de huid van sommige mensen voorkomt. Hier kan deze bacterie aanleiding geven tot het ontstaan van ontstekingen (b.v. steenpuisten).

Verder is deze bacterie gevreesd bij de voedselbereiding. M.n. de coagulase positieve stammen van deze bacterie worden in staat geacht een toxine te vormen.

Het vervelende van dit enterotoxine is dat het hittebestendig is. Hierdoor is een verhitting vlak voordat consumptie plaatsvindt van voedsel waarin dat toxine aanwezig is niet meer effectief. Om mogelijke nadelige consequenties van Staphylococcus aureus te voorkomen moet men streven naar een zo laag mogelijke besmetting van het voedingsmiddel met deze bacterie. Verder dient men ervoor te zorgen dat Staphylococcus aureus niet kan gaan groeien (toxine vorming treedt doorgaans op als er een behoorlijke groei heeft plaatsgevonden (vanaf 104 tot 105 ).

Staphylococcus aureus wordt geacht aanwezig te zijn als bij bebroeding van een mengsel van de voorgeschreven hoeveelheid monster (in ons geval nemen we 1 gram) en een ophopingsmedium van Giolotti Cantoni Bouillon bij 24-48 uur bij 37 °C een zwartkleuring wordt waargenomen.

Vervolgens wordt uit deze bouillon afgestreken op Baird-Parkeragar met een eidooier emulsie. Specifieke kolonies van Staphylococcus aureus zijn glanzend rond en bolvormig. De kolonies zijn gitzwart van binnen en hebben een heldere hof. Binnen deze hof kan een kleinere dof hof aanwezig zijn.

Bevestiging van coagulase activiteit wordt uitgevoerd op Baird-Parkeragar met daaraan toegevoegd RPF (Rabbit Plasma Fibrinogeen) supplement. Dit supplement bevat o.a. konijnenbloedplasma. Coagulase positieve kolonies vertonen een ondoorschijnende hof op dit medium.


2.4.2 Benodigdheden


  • Cultuurbuizen gevuld met Giolotti Cantoni Broth (handelspreparaat van Oxoid)

  • Potassium Tellurite Oplossing (handelspreparaat van Oxoid)

  • Steriele 2% agaroplossing

  • Baird-Parkeragar (handelspreparaat van Oxoid)

  • Eidooieremulsie: Egg Yolk Tellurite Emulsion supplement (handelspreparaat van Oxoid)

  • Konijnbloed plasma Rabbit Plasma Fibrinogeen supplement (handelspreparaat van Oxoid). Dit is een extreem dure hulpstof!

2.4.3 Bereidingen

2.4.3.1 Cultuurbuizen gevuld met Giolotti Cantoni Broth


Suspendeer 54.2 gram van het handelspreparaat in 1 liter gedestilleerd water. Verhit voorzichtig om alles op te lossen. Verdeel de vloeistof in porties van 19 ml over cultuurbuizen. Steriliseer m.b.v. autoclaaf bij 121°C gedurende 15 minuten. Koel snel of en voeg aseptisch 0,3 ml steriele Potassium Tellurite oplossing toe. Deze toevoeging is nodig om de groei van concurrerende micro-organismen te verhinderen. Verder is een steriele 2% agar oplossing nodig om de cultuurbuizen van de buitenlucht af te sluiten.

2.4.3.2 Basis Baird-Parkeragar


Suspendeer 63 gram van het handelspreparaat in één liter gedestilleerd water. Breng dit mengsel voorzichtig aan de kook onderwijl goed roeren. Breng de oplossing over in afsluitbare erlenmeyers en steriliseer deze bij 121°C gedurende 15 minuten in een autoclaaf.

2.4.3.3 Baird-Parkeragar met eidooieremulsie


Koel de gesteriliseerde agar terug tot ca 50°C en voeg op aseptische wijze per liter Baird-Parkeragar 50 ml van de eidooieremulsie met tellurite (SR54) toe. Meng goed en giet vervolgens de platen met de agar. De platen met de gestolde agar moeten bij 4°C bewaard worden.

2.4.3.3 Baird-Parkeragar met konijnenbloedplasma


Voeg 10 ml steriel gedestilleerd water toe aan een flesje van het handelspreparaat RPF supplement (SR 122). Dit oplossen duurt ca. 2 tot 3 uur.

Koel de gesteriliseerde agar terug tot ca 50°C en voeg op aseptische wijze per 100 ml Baird-Parkeragar 1 flesje met de opgeloste RPF supplement toe. Meng goed en giet vervolgens de platen met de agar. De platen met de gestolde agar moeten bij voorkeur direct worden gebruikt.


2.4.4 Werkwijze

2.4.4.1 Ophoping


Breng 1 gram van het gehakt op aseptische wijze over in de Giolotti Cantoni Bouillon met de Potassium tellurite oplossing daaraan toegevoegd. Meng voorzichtig door zonder schuim te maken. De enting op deze bouillon moet direct na het koelen na het steriliseren plaatsvinden. Als dit vertraagd verloopt moet het medium opnieuw van gas worden ontdaan door het m.b.v. stoom op te warmen.

Na het enten wordt voorzichtig een laagje 2% zuivere agaroplossing of steriele parafine op de bouillon aangebracht. Dit om een enigszins anaëroob milieu te realiseren.

Na het stollen van de agar moeten de buizen bebroed worden bij 35 °C. gedurende 48 uur.

2.4.4.2 Isolatie en bevestiging


Strijk van uit de Giolotti Cantoni bouillon over op de platen met Baird-Parkeragar met eidooieremulsie (zie bereiding § 2.4.3.2).

Zie voor de wijze van afstrijken § 2.3.4.3

De platen moeten eerst voorverwarmd worden op 35°C

Bebroed de platen na het enten gedurende 24 uur op 35°C +/- 0,5.. Onderzoek of er specifieke kolonies aanwezig zijn op de plaat. Specifieke kolonies zijn:



  • Glanzend

  • Bolvormig

  • Rond

  • Gitzwart

  • Omgeven door een heldere hof (mogelijk met een kleinere doffe binnenste hof)

Onderzoek de platen tevens na 48 uur. Bewaar de platen hierna in de koelkast

We onderzoeken tevens of er Staphylococcus aureus aanwezig is met de eigenschap bloedplasma te coaguleren. Dit doen we op Baird-Parkeragar met het RPF supplement (zie bereiding § 2.4.3.3).

De platen moeten vers gegoten worden.

Ent van uit een specifieke kolonie op de Baird-Parkeragar plaat met eidooieremulsie over op de platen met Baird-Parkeragar met konijnenbloedplasma. Bebroed de platen met het RPF supplement hierna 24 uur bij 35 °C gedurende 24 uur. Indien geen reactie te zien is vervolgens nog eens na 48 uur de platen beoordelen. Coagulase positieve Staphylococcus aureus laten op dit medium kolonies zien met verschillende kleuren (naast zwarte zijn ook grijze of witte kolonies mogelijk). Specifiek is de doorschijnende hof rond de kolonie.



3. Rauwkostsalade

3.1 Inleiding


We maken voor dit onderzoek gebruik van rauwkostsalade afkomstig uit de supermarkt.

Afhankelijk van de beginbesmetting van de grondstof en de verdere behandeling, de verpakkingswijze en de bewaartemperatuur zullen hierin verschillende typen van micro-organismen tot ontwikkeling kunnen komen.

Deze micro-organismen kunnen zowel voor de houdbaarheid als voor de gezondheid van de consument van belang zijn.

Wij zullen ons beperken in dit microbiologisch onderzoek tot:



  1. Totaal aëroob kiemgetal (van belang voor de houdbaarheid)

  2. Coli achtigen (van belang voor de detectie van mogelijke ziekteverwekkers)

  3. Lactobacillen (wederom van belang voor de houdbaarheid)

3.2 Aëroob koloniegetal

3.2.1 Inleiding (zie 2.2.1)

3.2.2 Benodigdheden (zie 2.2.2)

3.2.3 Bereiding PCA (zie 2.2.3)

3.2.4 Werkwijze


Bij de beoordeling moet tenminste van 50 gram monster worden uitgegaan. Dit kan men doen door tenminste 50 gram monster op aseptische wijze in een stomacherzak aan te brengen. Vervolgens aseptisch 200 gram steriele PFZ oplossing toevoegen. Deze vervolgens een vaste tijd homogeniseren m.b.v. de Stomacher. Wij hebben nu een oplossing met 1/5 gram voedingsmiddel per ml gehomogeniseerde vloeistof.

We kunnen de oplossing op de gebruikelijke wijze verder verdunnen.

Deze oplossing gebruiken we ook voor het overige onderzoek. Zorg dat alles hiervoor ook klaarstaat!

Gebruik voor elke decimale verdunning 2 petrischalen. Pipetteer in elk van deze petrischalen 1 ml van het verdunde product.

Voeg ca 10 tot 15 ml PCA van 48 °C toe aan elke petrischaal. Meng vervolgens door de plaat voorzichtig in achtvorm over de tafel te schuiven. Let er hierbij op dat de agar niet de deksel raakt.

Bebroed de platen met de agarbodem omhoog gedurende 72 +/- 3 uur bij 30°C +/- 1°C. (Dit valt bij ons practicum in het weekend. Daarom op na 2 dagen en na 5 dagen tellen.)




3.3 E coli en Coli-achtigen

3.3.1 Inleiding


We willen de aanwezigheid van Escherichia coli en coli-achtigen in 1 gram rauwkostsalade vaststellen. Hiertoe kunnen we weer uitgaan van het gehomogeniseerde monster (zie 3.2.4).

E coli wordt geacht aanwezig te zijn bij een positieve groei met gasvorming (te detecteren met het Durham buisje) binnen 16 – 20 uur in een selectief medium (briljant groen bouillon) bij een temperatuur van 44 +/- 0,1 °C. Deze nauwe tolerantie is alleen in een waterbad te realiseren.

Alleen de temperatuur is de extra selecterende factor t.o.v. de andere coli-achtigen. Het medium is selectief door de aanwezigheid van:

a. galzouten (die normaal ook in een darmkanaal aanwezig zijn).

b. briljant groen dat grampositieve bacteriën remt

c. lactose als enige suiker (specifiek voor coli-achtigen t.o.v. andere enterobacteriaceae).

De test op de aanwezigheid van coli-achtigen wordt op een identieke voedingsbouillon echter bij 30 i.p.v. 44 °C uitgevoerd.

Officieel is er ook nog een isolatie en bevestiging nodig. Deze laten we bij dit practicum echter achterwege.


3.3.2 Benodigdheden


  • Cultuurbuizen

  • Durhambuisjes

  • Briljantgroen bouillon (op dubbele sterkte)

  • Steriele pipetten van 5 ml

3.3.3 Bereiding Brillant Green Bile Broth (= Briljantgroen Gal bouillon) op dubbele sterkte.


Los 80 gram van het handelspreparaat op in 1 liter gedestilleerd water. Goed mengen om een heldere oplossing te krijgen. Breng in elke cultuurbuis voor zien van een durhambuisje 10 ml van deze oplossing. Steriliseer m.b.v. een autoclaaf bij 121 °C gedurende 15 minuten. Bewaring van de toebereide buizen dient bij 2-8°C plaats te vinden.

3.3.4 Werkwijze


Breng 5 ml van het gestomacherde mengsel over in de steriele cultuurbuizen (met 10 ml briljant groen bouillon en durhambuisje). Voeg vervolgens 5 ml steriel gedestilleerd water toe. Meng voorzichtig zodat er geen gas onder in het durhambuisje kan komen. Bebroed bij 30°C (onderzoek op coli-achtigen) gedurende 18-24 uur en de andere buis op 44°C +/- 0,1. De bebroeding bij 44°C moet in een waterbad plaatsvinden om een voldoende nauwkeurige temperatuurregeling te kunnen garanderen. Positief zijn de buizen waarin gasvorming is opgetreden.

3.4 Lactobacillen

3.4.1 Inleiding


Onder het aantal kolonievormende eenheden van het geslacht Lactobacillus wordt verstaan het aantal kolonies, dat zich na 3-5 dagen ontwikkelt op Rogosa agar bij 30°C. Dit medium is speciaal aangepast voor de veeleisende Lactobacillus. Het selectieve karakter ontstaat door de lage pH en de anaërobe omstandigheden. Deze anaërobe omstandigheden worden verkregen door boven op de gestolde agar in de gietplaat een extra laagje agar te gieten.

De kolonies die grampositieve staven laten zien en katalase negatief zijn worden geacht tot het geslacht Lactobacillus te behoren. (Zie hiervoor de practicum handleiding van de tweede klas. Toegevoegd als bijlage)


3.4.2 Benodigdheden


  • Rogosa agar (handelspreparaat van OXOID)

  • Petrischalen (doorsnee 9 cm)

  • Verdunningsvloeistof: Pepton Fysiologische Zout oplossing (PFZ) in reageerbuizen met dop voor het maken van decimale verdunningen

  • Steriele 1 ml pipetten

3.4.3 Bereiding Rogosa agar


Suspendeer 83 gram van het handelspreparaat in 1 l gedestilleerd water. Breng dit mengsel aan de kook terwijl men dit blijft roeren. Houdt dit mengsel op 90 – 100 °C gedurende 2-3 minuten. Verdeel deze oplossing over steriele flessen. Niet steriliseren m.b.v. de autoclaaf!

3.4.4 Werkwijze


Ga uit van de verdunningsreeks zoals deze al voor het aëroob koloniegetal werd gemaakt. Kies de verdunning zodanig dat het te tellen aantal kolonies tussen de 30 en 300 zal komen te liggen. Breng telkens 1 ml van de verschillende verdunningen aan op de bodem van 2 petrischalen. Giet vervolgens de petrischalen met de tot ca 48°C afgekoelde Rogosa agar. Meng de agar op de petrischalen goed met de gepipetteerde 1 ml van de verdunningsreeks. Na stolling van de eerste laag agar dient een tweede laag Rogosa agar van ca 4-5 mm op de eerste laag te worden aangebracht. Dit is nodig om anaërobe omstandigheden in de eerste agarlaag te realiseren. Bebroed de platen bij 30 °C gedurende 3-5 dagen. Tel na afloop het aantal kolonies zo mogelijk van die platen waarop het aantal kolonies tussen de 30 en 300 ligt.

Voer op enkele kolonies (tenminste 3) het bevestigingsonderzoek uit. Dit bestaat uit:



  1. Gramkleuring (zie bijlage 1) Lactobacillus is grampositief Zie Bijlage ..

  2. Katalase test (zie bijlage) Lactobacillus is katalase negatief.

4. Tompouce

4.1 Inleiding


Tijdens de bereiding/verpakken van de tompouce kunnen er allerlei soorten microorganismen aanwezig zijn. Tijdens dit practicum zullen we telingen uitvoeren van de in de tompouce aanwezige Enterobacteriaceae, Bacillus cereus en Gisten.

Het onderzoek op E coli en Staphylococcus aureus hebben we reeds bij het onderzoek op rauwkostsalade en gehakt of gemalen vlees uitgevoerd.

Om een vetrijk product goed te kunnen verdunnen wordt voor de eerste verdunning geen PFZ maar een steriele 2% oplossing van natriumcitraat gebruikt van ca 50°C.

4.2 Telling en identificatie van Enterobacteriaceae.

4.2.1 Inleiding


De telling van enterobacteriaceae geeft een indicatie van de hygiëne tijdens de melkwinning en de tompoucebereiding. Bij de telling worden alle mogelijke varianten van enterobacteriaceae bepaald. Tot deze familie behoren de geslachten van o.a. E coli, de Salmonella en de Shigella.

Bij de identificatie maken we gebruik van een kant-en-klare testtube – de zogenaamde enterotube. Hierin zijn een groot aantal specifieke media aanwezig waarop de specifieke reacties zijn af te lezen. M.b.v. de bijgeleverde gebruiksaanwijzing kan men de soort identificeren.


4.2.2 Benodigdheden:


  • VRBG agar -Violet red Bile Glucose agar. (handelspreparaat van OXOID)

  • Petrischalen (doorsnee 9 cm)

  • Steriele 2 % oplossing van Natriumcitraat (Na3C6H5O7.5 ½ H2O)in gedestilleerd water 450 ml in erlenmeyer van voldoende inhoud.

  • Verdunningsvloeistof: Pepton Fysiologische Zout oplossing (PFZ) in reageerbuizen met dop voor het maken van decimale verdunningen.

  • Steriele 1 ml pipetten

  • Kant-en-klare enterotube. (zie bijlage voor een foto)

4.2.3 Bereiding VRBG agar


Suspendeer 38,5 gram van het handelspreparaat op in 1 liter gedestilleerd water. Breng het mengsel onder goed roeren aan de kook. Verdere sterilisatie is niet nodig en ongewenst. Koel af tot ca 48°C. Meng goed voor het gebruik.

4.2.4 Werkwijze


Weeg tenminste 50 gram van de tompouce op aseptische wijze af in 450 gram steriele 2% natriumcitraat oplossing. Verwarm dit mengsel totdat de structuur van tompouce volledig is verdwenen. Als de tompouce volledig is opgelost kan men verder gaan met het op de bekende aseptische wijze verdunnen van het mengsel. (Decimale verdunningen)

Breng van elke decimale verdunning 1 ml verdunningsvloeistof over in twee steriele petrischalen.

Hierna kan men de tot 48°C afgekoelde VRBG-agar op de platen gieten. Meng vervolgens de gepipetteerde vloeistof voorzichtig met de agar door de platen in de vorm van achtjes over de tafel te bewegen. Laat de agar hierna stollen.

Als de eerste laag agar is gestold dient men een tweede laag agar (ca 10 ml) over de eerste laag heen te gieten. Hierdoor ontstaat een enigszins anaëroob milieu waardoor de omzetting van de suikers resulteert in zuurvorming. Deze zuurvorming is hierna te zien in de vorm van een helder hofje rondom de kolonies van de Enterobacteriaceae.

Bebroed de platen met de agar omhoog bij 30°C gedurende 19 tot 24 uur.

Beoordeel en tel de kolonies met een helder hofje.

Voer van 1 specifieke goed losliggende kolonie een identificatie uit m.b.v. de Enterotube. Breng met de centrale naald een weinig bacteriemateriaal uit het centrum van een losliggende kolonie over in de Enterotube. Steek de naald in een soepele beweging door alle mediadelen van de tube. Bebroed en beoordeel volgens voorschrift. (Is bijgeleverd)

4.3 Telling van Bacillus cereus

4.3.1 Inleiding


Bacillus cereus is een bacteriesoort van de familie Bacillaceae. Dit geslacht omvat de geslachten Clostridium (anaërobe bacteriën) en het geslacht Bacillus (aëroob of facultatief anaëroob) soorten. Bacillaceae zijn staafvormige en sporenvormende bacteriën. Bacillus cereus wordt vooral aangetroffen in gepasteuriseerde melk en zuivelproducten. De sporen van Bacillus cereus zijn weliswaar niet heel erg hittebestendig maar een pasteurisatie kunnen de sporen wel doorstaan.

Tot de Bacillaceae behoren vele gevreesde bacteriën b.v. Bacillus antracis (veroorzaker van miltvuur), Clostridium botulinum (veroorzaker van botulisme), Clostridium tetani (veroorzaker van tetanus), Clostridium perfringens (voedselvergiftiger).

Bacillus cereus kan een enterotoxine vormen dat een voedselvergiftiging veroorzaakt.

Het aantal kolonievormende eenheden van de soort Bacillus cereus wordt verstaan het aantal specifieke kolonies, dat zich per gram product ontwikkelt op het medium op een specifiek medium van Bacillus cereus selective agar base voorzien van Polymyxin B. Formeel dienen eveneens en identificatie te worden uitgevoerd. Deze identificatie laten wij echter achterwege.

Polymyxine onderdrukt de groei van een groot aantal concurrerende bacteriën. De aanwezigheid van mannitol (dat niet door Bacillus cereus wordt aangetast) en een indicator maakt het mogelijk om andere Bacillussoorten te onderscheiden van Bacillus cereus.

Uit de in het medium aanwezige eidooier kan Bacillus cereus -door de aanwezigheid van het enzym fosfolipase- rond de kolonie een brede hof met een witte neerslag vormen. De kolonies zijn hieraan gemakkelijk te herkennen.


4.3.2 Benodigdheden


  • Bacillus cereus selective agar base (handelspreparaat van Oxoid0

  • Polymyxin supplement (handelspreparaat van Oxoid)

  • Egg Yolk Emulsion (handelspreparaat van Oxoid)

  • Verdunningsvloeistof: Pepton Fysiologische Zout oplossing (PFZ) in reageerbuizen met dop voor het maken van decimale verdunningen.

  • Steriele 1 ml pipetten

4.3.3 Bereiding Bacillus cereus selective agar base (met toevoegingen van eidooier en Polymyxine)


Suspendeer 20,5 gram in 475 ml gedestilleerd water en breng voorzichtig aan de kook. Roer de oplossing om aanbranden te voorkomen. Steriliseer de oplossing m.b.v. een autoclaaf gedurende 15 minuten op 121°C. Koel vervolgens terug tot 50°C.

Voeg hierna het Bacillus cereus supplement (SR99) toe. Dit supplement dient voor de toevoeging met 2 ml steriel gedestilleerd water te worden gereconstitueerd.

Vervolgens dient 25 ml van de steriele Egg Yolk Emulsion te worden toegevoegd.

Dit mengsel goed doormengen en vervolgens op steriel petrischalen uitgieten. De platen dienen bij 2-8°C te worden bewaard


4.3.4 Werkwijze


Ga uit van de verdunningsreeks zoals deze ook reeds gemaakt t.b.v. de telling van de Enterobacteriaceae (zie 4.2.4). We gebruiken bij de telling van Bacillus cereus uit van de strijkplaat methode. Hiertoe dient men telkens 0,1 ml (met steriele 1 ml verdeelpipet) op de plaat te pipetteren. Vervolgens dient deze vloeistof onmiddellijk te worden verdeeld met een Drigalski-spatel. (Gebogen glazen spatel). Indien men snel werkt kan men de hele reeks met 1 spatel afwerken. Begin met het verdelen met de laagste verdunning. Vervolgens verdeelt men de vloeistof bij de op één laagste verdunning etc. (dit vanwege een krappe hoeveelheid Drigalski-spatels)

Bebroed de platen met de agarbodem omhoog 24 zonodig 30 uur bij 30°C +/-1.

Tel het aantal specifieke kolonies (met hof).


4.4 Telling van het aantal gisten.

4.4.1 Inleiding


Gisten kunnen behoren tot de bederfflora op zachte tompoucesoorten. Onder het aantal kolonievormende eenheden van gisten wordt verstaan het aantal kolonies van gisten dat zich per gram of ml van een levensmiddel ontwikkelt op OGYE agar na bebroeding gedurende 2-5 dagen bij 20-25°C.

Het medium ontleent zijn specificiteit aan de toevoeging van een breed spectrum antibioticum (oxytetracycline)


4.4.2 Benodigdheden


  • Verdunningsvloeistof: Pepton Fysiologische Zout oplossing (PFZ) in reageerbuizen met dop voor het maken van decimale verdunningen.

  • Steriele 1 ml pipetten

  • Oxytetracycline Yeast extract Glucose Agar (OGYE) (Handelspreparaat van Oxoid)

  • Oxytetracycline GYE supplement (Handelspreparaat van Oxoid)

4.4.3 Bereiding Oxytetracycline Yeast extract Glucose Agar (OGYE)


Suspendeer 18,5 gram handelspreparaat in 500 ml gedestilleerd water. Breng het mengsel voorzichtig aan de kook onderwijl goed roeren. Goed door tot alles goed is opgelost.

Steriliseer m.b.v. een autoclaaf op 115°C gedurende 10 minuten. Laat het medium afkoelen tot 50 °C.

Voeg op een aseptische wijze aan een flesje droog supplement 10 ml gesteriliseerd gedestilleerd water toe. Los het poeder geheel op.

Voeg de inhoud van het opgeloste supplement toe aan 500 ml OGYE agar van 50 °C. Doe dit alles op een aseptische wijze.


4.4.4 Werkwijze


Ga uit van de verdunningsreeks zoals deze ook reeds gemaakt t.b.v. de telling van de Enterobacteriaceae (zie 4.2.4). Pipetteer van elke verdunning 1 ml op 2 petrischalen. Voeg hierna ca 15 ml van het bereide medium toe. Meng vervolgens de gepipetteerde vloeistof voorzichtig met de agar door de platen in de vorm van achtjes over de tafel te bewegen. Laat de agar hierna stollen.

Bebroed de platen gedurende 2 tot 5 dagen bij 20-25°C. (kamertemperatuur)

Tel apart de kolonies van gisten en de mogelijk aanwezige schimmels.


Bijlage 1: Kleuring van Bacteriën.


Voor het waarnemen van microbiële cellen hebben we een microscoop nodig. Om het contrast tussen de bacteriecel en zijn omgeving te vergroten, worden allerlei kleurmethoden toegepast. In het algemeen gebruikt men basische kleurstoffen, zoals methyleenblauw.. Soms kleurt men zodanig, bijvoorbeeld in de kleuring volgens Gram, dat er meer gebeurt dan alleen maar kleuren. Bij die kleuringen is het doel onderscheid te maken tussen bacteriesoorten, omdat de ervaring heeft geleerd dat bacteriesoorten zich anders kunnen manifesteren in dergelijke kleuringen.

In dit werkblad beschrijven we achtereenvolgens hoe je bacteriën kleurt met methyleenblauw (A) en volgens het Gram-protocol (B).


Materiaal

- Objectglazen.

- Kleurstoffen.

- Microscoop (bij voorkeur met een olie-immersie-objectief).


Uitvoering

  1. Als je uitgaat van een cultuur op een schuine agar, dan breng je eerst op het objectglas een druppeltje leidingwater aan met een klein entoog.

  2. Breng met een steriel entoog wat van de bacteriecultuur (niet te veel) in de vloeistof een meng de bacteriën met de vloeistof door met het entoog de massa een beetje te spreiden op een klein oppervlak op het objectglas.

  3. Als je uitgaat van een vloeibare bacterieculture, dan neem je met een steriel entoog een druppel cultuur en die breng je op het objectglas aan, waarna dit druppeltje wordt uitgespreid op een klein oppervlak.

  4. Laat de opgebrachte bacteriecellen aan de lucht drogen.

Als de druppel is ingedroogd, wordt het preparaat gefixeerd – de cellen worden aan het glas gehecht – door het objectglas met een pincet enige malen door een vlam te halen (niet in de vlam houden).

De preparaten kunnen nu worden gekleurd.


A. METHYLEENBLAUW-KLEURING (niet bij dit practicum)


  1. Breng een vijftal druppels methyleenblauw-oplossing (met bijvoorbeeld een pipetje dat wordt gebruikt om oogdruppels in te brengen) aan op het preparaat.

  2. Na 30 seconden spoel je met een spuitfles de kleurstof van het objectglas af (spuit niet midden in het preparaat, maar spuit voorzichtig vanaf de bovenkant van het preparaat).

  3. Droog het preparaat tussen een filtreerpapiertje en bekijk het resultaat met de grootste vergroting.



B. GRAM-KLEURING


  1. Breng eerst kristalviolet op het preparaat aan en laat dat gedurende een minuut inwerken.

  2. Spoel ook nu, net als hierboven aangegeven, het kristalviolet af met water.

  3. Breng nu lugol op het preparaat aan en laat dit gedurende 30 seconden inwerken.

  4. Spoel af met water.

  5. Behandel het preparaat met een 96% alcoholoplossing door voorzichtig vanuit een spuitfles alcohol over het preparaat te laten lopen.

  6. Als de alcohol die van het preparaat loopt geen kleurstof meer bevat, spoel het preparaat dan af met water.

  7. Kleur het gedurende één minuut na met waterige fuchsine en spoel het opnieuw af met water.

  8. Droog het preparaat tussen filtreerpapier en bekijk het onder de microscoop.

Resultaat

Grampositieve cellen houden de paarse kleur die ze krijgen door de behandeling met kristalviolet en lugol vast, ook na de behandeling met alcohol, ze blijven ook na de kleuring met waterige fuchsine paars.

De Gramnegatieve cellen verliezen het paarse kleurcomplex na de alcoholbehandeling en kleuren rose door het waterige fuchsine.


Hoe zien Lactobacillen eruit?

Let ook op de grondvorm van de cel: de Lactobacillus is een staaf, de E. coli is een klein staafje (bijna bolvormig) en de S. aureus is een bolvormige cel. De cellen van de laatstgenoemde bacterie hebben de neiging om in trossen bij elkaar te blijven na de celdelingen.

Figuur : Electronenmicrospische opname van E coli, Staphylococcus en Bacillus en

S
chematisch overzicht gramkleuring



Bijlage 2 De entero tube





Bij deze methode wordt een testbuis, die in de lengte in 12 vakjes is verdeeld, voorzien van verschillend samengestelde voedingsbodempjes. Door de buis steekt een lange entnaald. Aan één zijde is deze spits (onder de witte dop) en aan de andere zijde voorzien van een lus, een soort handvat(onder de blauwe dop).We kunnen de buis enten door de naald (niet uitgloeien !!) in een vrijliggende kolonie te steken. Op deze wijze nemen we wat bacteriemateriaal aan. Vervolgens kan men met één langzame draaiende beweging de naald naar buiten te trekken de gehele buis beënten. Nadat de puntvan de naald alle vakjes heeft beënt moet deze weer een stukje worden teruggestoken en op de voorbehandelde plaats worden afgebroken.

Vervolgens moet de buis worden bebroed bij 30°C gedurende 24 uur.

De resultaten van de positieve en negatieve reacties op de verschillende media kan door toekenning van een bepaalde waarde een vijfcijferige code opleveren. De z.g. ID-value (=Identification Value).

Dit vijfcijferige getal kan in een databoek of databank (computer) worden opgezocht. Het resultaat is de meest waarschijnlijke bacteriesoort en de waarschijnlijkheid.

Bijlage 3: Isolatie en zuivering

Voor het afstrijken ter zuivering wordt de volgende techniek aanbevolen: Tip met het oogje van de entnaald een bij voorkeur losliggende kolonie in het centrum aan. Maak met het oog van de naald 4 of 5 evenwijdige dicht bij elkaar gelegen strepen aan één zijde van de plaat. (Zie 1 bij onderstaande figuur). Gloei de naald opnieuw uit en laat deze afkoelen (in alcohol en vervolgens de alcohol voorzichtig afbranden).

Maak hierna zonder nieuw bacteriemateriaal aan de naald te nemen opnieuw 4-5 strepen onder een hoek van ca 105° met de eerste serie zodanig dat deze worden gekruist. (Zie 2 bij onderstaande figuur). Herhaal deze handeling nog twee keer (zie 3 en 4 bij onderstaande figuur). Breng vervolgens een streek naar het centrum van de plaat. (Zie 5 bij onderstaande figuur). Gloei steeds de naald uit tussen de handelingen 2,3,4, en 5.

Op deze wijze is de kans dat u losliggende kolonies verkrijgt groot.





Bijlage 4. Uitvoering katalase test

Benodigdheden:



  • Alcohol

  • Brander

  • Entnaald (öse)

  • Objectglaasje

  • 3% H2O2

Werkwijze:



  1. Breng met een steriele öse bacteriemateriaal aan op een schoon objectglaasje

  2. Laat voorzichtig een druppel 3% H2O2 op het bacteriemateriaal vallen

  3. Beoordeel of er gasbelletjes ontstaan. Indien gasbelletjes ontstaan is de conclusie dat de bacterie katalase positief is. Lactobacillen dienen katalase negatief te zijn.




pagina:




De database wordt beschermd door het auteursrecht ©opleid.info 2017
stuur bericht

    Hoofdpagina