Werkblad simulatie hplc



Dovnload 184.3 Kb.
Datum30.09.2016
Grootte184.3 Kb.

Werkblad simulatie HPLC

Inhoudsopgave




Werkblad simulatie HPLC 1

1. Hoe zien de componenten eruit? 2

2. Het maken van een goed chromatogram (methodeontwikkeling). 4

3. Selectie 7

4. Andere kolommen 8

5. Injectievolume 9


Werk de handleiding ”Leren werken met HPLC sim 2001” door.


1. Hoe zien de componenten eruit?

Ga na welke componenten geïnjecteerd kunnen worden en vul onderstaande tabel verder in.


Geef voor alle componenten die te meten zijn de structuurformule en het soort verbinding (alkaan, alkohol, ester, ether, aromaat, nitroverbinding enz.) en de systematische naam. Voor de systematische naam kun je gebruik maken van Chemsketch.


Nr

Engelse

Naam


Nederlandse Naam

Structuurformule

Soort verbinding

Systematische naam

1

phenol












2

p-nitrophenol












3

p-cresol












4

2,5-xylenol












5

methyl benzoate












6

anisole















7

benzene












8

phenetole












9

toluene












Hoe zien het eluaat eruit?




Engelse naam

Nederlandse naam

Structuurformule

Systematische naam

methanol









acetonitrile









tetrahydrofuran











2. Het maken van een goed chromatogram (methodeontwikkeling).

We gaan nu proberen om een chromatogram te maken, waarbij alle pieken goed gescheiden zijn en waarbij het chromatogram binnen 15 minuten klaar is.


Stel het apparaat als volgt in:


Detector




mode

diode array

wavelength

200

sensitivity

1

Kolom

DuPont C-18

Loopvloeistof

MeOH

Controle panel




isocratic




flow

1 ml/min

%B

0 %

inj volume

10 µl

Maak een monster klaar met 3 µl/ml van elke 9 aanwezige componenten of gebruik het bestaande monster all1.spl met 1 µl/ml van elke 9 aanwezige componenten (met load).

Injecteer bij diverse percentages MeOH in het eluent (zie onderstaande tabel).

Kies steeds een sensitivity bij de detector, zodat de pieken volledig en goed zichtbaar zijn.

Gebruik het computer Data systeem (Data/View Rescale chromatogram) om het chromatogram goed te bekijken voor de scheiding van de pieken.
Maak een chromatogram voor de loopvloeistof samenstellingen in onderstaande tabel en noteer de gevonden retentietijden in min.

Noteer ook voor de chromatogrammen met 9 pieken die binnen 15 min. gemaakt worden, welke pieken die niet geheel gescheiden zijn (geen terugkeer naar de basislijn tussen de pieken).


Tabel van de gevonden retentijden bij diverse percentages methanol

component



1

2

3

4

5

6

7

8

9

niet gescheiden

% MeOH






























100































90































80































70































60































50































Zo lukt het niet een goed chromatogram te krijgen.

We stappen over van MeOH naar acetonitril (ACN).

Tabel van de gevonden retentijden bij diverse percentages acetonitril

component



1

2

3

4

5

6

7

8

9

niet gescheiden

% ACN






























100































90































80































70































60































50































We stappen over van ACN naar tetrahydrofuraan (THF).


Tabel van de gevonden retentijden bij diverse percentages tetrahydrofuraan

component



1

2

3

4

5

6

7

8

9

niet gescheiden

% THF






























100































90































80































70































60































50































40































Er wordt nog geen chromatogram gevonden die aan alle eisen voldoet.
We kiezen voor MeOH, ACN en THF het beste chromatogram (Vul zelf het percentage in).

De retentietijden van de componenten worden ook gemeten om de pieken te identificeren.


(meet met een concentratie van 1 mg/ml, bij slechte detectie een hogere concentratie nemen)


component

retentietijd

MeOH


%

piek-nr

retentietijd

ACN


%

piek-nr

retentietijd

THF


%

piek-nr

fenol



















p-nitrofenol



















p-cresol



















2,5-xylenol



















methylbenzoaat



















anisol



















benzeen



















fenetol



















tolueen


















Wat valt op bij het gebruik van de 3 verschillende oplosmiddelen MeOH, ACN en THF (vul in)?






Wanneer het chromatogram bestaat uit dicht bij elkaar staande pieken in het begin en aan het eind ver van elkaar staande pieken dan kan gradiënt-elutie het chromatogram verbeteren.


Voer gradiënt-elutie uit voor methanol en vul onderstaande tabel in (ook % methanol, van…% tot …%, zelf invullen), looptijd chromatogram 15 minuten .
Tabel van de gevonden retentijden bij gradiënt-elutie bij methanol

component



1

2

3

4

5

6

7

8

9

niet gescheiden

% MeOH






























- %




























alles gescheiden

Nu worden de pieken geïdentificeerd.. Ditmaal door spiking. Aan een standaard waarin elke component met een concentratie van 1 mg/l aanwezig is gaan we steeds van één component de concentratie verhogen tot 2 mg/. Uit het oppervlak van de pieken is dan te zien welke piek hoort bij welke component. Vul % methanol in.


Tabel van de gevonden oppervlakten bij - % MeOH, sensitivity 0,5

component



1

2

3

4

5

6

7

8

9

identificatie van piek nr.

geen toevoeging































toegevoegd

1 mg/l


xxxx

xxxx

xxxx

xxxx

xxxx

xxxx

xxxx

xxxx

xxxx




fenol































p-nitrophenol































p-cresol































2,5-xylenol































methyl benzoaat































anisol































benzeen































fenetol































tolueen

































3. Selectie

Het kan voorkomen dat men alleen geïnteresseerd is in één component in een mengsel. Dan gemeten worden bij een golflengte waarbij die ene component absorbeert en de andere componenten niet.


Daarvoor kan je gebruikmaken van:

Computerdatasysteem/Data/Diode Array Options…/UV-spectrum at a given elutiontime


Bekijk met behulp van de bekende elutietijden de spectra van de componenten.
Selecteer een golflengte waarbij p-nitrofenol wel het licht absorbeert en de andere componenten niet. Vul de gevonden waaarde van de golflengte in.


golflengte

nm

Stel de detector in op gevonden golflengte en injecteer het standaardmengsel.

Als het goed is zie je maar één piek die dezelfde retentietijd heeft als p-nitrofenol.

4. Andere kolommen

Ga na of andere beschikbare kolommen andere resultaten opleveren.


Maak een chromatogram met het bekend standaardmengsel met 9 componenten met de kolom die je tot nu toe gebruikt hebt DuPont C-18

Sla het chromatogram op met:


Computerdatasysteem/File/Save chromatogram onder een toepasselijke naam (bijv. DuPont18)
Ga over op een andere kolom.

Maak weer een chromatogram met hetzelfde monster.

Vergelijk de chromatogrammen met:
Computerdatasysteem/Data/Compare two chromatograms

Er wordt gevraagd naar het chromatogram dat opgehaald moet worden (retrieve):

Kies: DuPont18

Dit chromatogram staat daarna onderaan.


Noteer je bevindingen in onderstaande tabel.


Kolom

Verschillen met DuPont C-18

DuPont C-8




Waters C18




Merck C8



Hypercil C-18






5. Injectievolume

Maak een 2 chromatogrammen van anisol (detectorgevoeligheid 1,00):



  • 10 ml geïnjecteerd met een concentratie van 1 mg/ml

  • 2 ml geïnjecteerd met een concentratie van 5 mg/ml

vergelijk de chromatogrammen.
Vul onderstaande tabel in.


Wat voor verschil zie je?




Welk verschil kan optreden bij heel kleine retentietijden?







De database wordt beschermd door het auteursrecht ©opleid.info 2017
stuur bericht

    Hoofdpagina