Werkcollege 4 (14/9) Technische focus met Colin de Vlaming Biochemistry and Molecular Biology II: Technical Focus / werkcollege, 2006



Dovnload 15.98 Kb.
Datum30.09.2016
Grootte15.98 Kb.
Werkcollege 4 (14/9) Technische focus met Colin de Vlaming
Biochemistry and Molecular Biology II: Technical Focus / werkcollege, 2006

The four core histones form an octameric structure that wraps about 150 bp of DNA into a left-handed superhelix. This structure is called a nucleosome and it is the fundamental repeat-unit of all eukaryotic chromosomes. Nucleosomal histones are subject to more than 50 different post-translational amino acid modifications.

Imagine you work with brewers’ yeast in the lab, that you sent a yeast protein fraction to a mass spectrometry facility that excels in the identification of post-translational modifications, and that they tell you that in your sample about 30% of histone H3 was acetylated at lysines 56. Careful analysis of the literature indicates that this has not been reported yet, indicating that you have found a new histone modification. What will you do now?

A1 Provide two independent, non mass spectrometry based, pieces of evidence that lysine 56 of histone H3 (H3-K56) is indeed acetylated in yeast cells. Go into details about the way you generate and validate the reagents you need. (hint 1: use an immunological technique, hint 2: use recombinant histone H3 produced in bacteria as this is unlikely to be acetylated)
1 De eerste methode voor het aantonen van deze epigenetische histon modificatie is het maken van een specifiek antilichaam voor de modificatie en vervolgens het aankleuren van de modificatie.

Het maken van zo’n zo’n specifiek antilichamen is een redelijk ingewikkelde klus.




  • Eerst wordt er op chemische wijze een peptide gemaakt die exact hetzelfde is als de histonstaart en die de acetyl-groep bezit op lysine 56.

  • Deze kunstmatige peptide wordt vervolgens ingespoten in een proefdier (konijn). De peptide wordt hiervoor eerst vastgemaakt aan een groter eiwit (KLH). Dit is een eiwit wat niet voorkomt in zoogdieren. Er kan dus geen beïnvloeding plaatsvinden van de proef. Vervolgens moet erg gecontroleerd worden of de antistof wel specifiek genoeg werkt. Hij wordt dus getest op een peptide zonder de modificatie (H3-K56)en op een peptide met deze modificatie. Er wordt getest bij verschillende verdunningen. Als alles goed verlopen is, is de antistof specifiek voor de peptide met modificatie.

  • Voor verderop in de proef wordt dan een antilichaam gemaakt wat specifiek is voor het eerste antilichaam. Dit gebeurt door het eerste antilichaam in een ander proefdier in te brengen. Meestal een geit, zo krijg je een Goat-anti-rabbit antilichaam. Dit moet zorgen voor de kleuring in het uiteindelijk experijment. Dat doet men door een peroxidase-activiteit bezittend enzym te binden aan het anti-antilichaam wat kleur en licht uitzendt (HRP – Horseradish Peroxidase).

  • Vervolgens kan het echte experiment beginnen. Er worden histonen geïsoleerd uit het doelweefsel door middel van lyse van cellen en vervolgens het brengen van het lysaat op een polyacrylamide gel. Hierbij is het belangrijk dat er SDS op de gel gebracht wordt, dit maakt namelijk de lading van de eiwitten geheel negatief (lading is hierbij evenredig met grootte). En op die manier bewegen alle eiwitten dezelfde richting op in de gel. Na deze gel moet er een western blot plaatsvinden. De eiwitten laat men migreren van gel naar een membraan. Dan wordt er een kleuring gedaan met de antilichamen en anti-antilichamen. (één van deze twee moet zichtbaar zijn door een labeling om het eiwitbandje zichtbaar te maken. Kleuren de antilichamen niets aan. Dan is de modificatie niet aanwezig. Is er wel een kleuring dan is de modificatie hoogstwaarschijnlijk wel aanwezig.

  • Tenslotte moet er een laatste controle plaatsvinden. Er wordt een gemanipuleerde gist opgebracht worden. Deze gist bezit een H3-subunit die veranderd is, bijvoorbeeld een verzwaring door het toevoegen van een ander domein of weglating van een domein. Als het goed is vind er dan een shift in de gevonden band van H3 plaats. Dit is het laatste bewijs dat er idd H3 aanwezig zijn en zo hebben de onderzoekers hun resultaten voldoende onderbouwd.


Blot

1 Blokkeren (Melk)

2 Binding (Melk + Antilichaam)

3 Wassen (3x 5 minuten) Non-specifieke binding voorkomen

4 Binding (Melk + Secundair antilichaam)

5 Wassen

6 ECL (Enzymatic Chemoluminescence) toevoegen (binding HRG)
Noot: het is uiteraard extreem belangrijk dat peptides zonder de modificatie NIET gekleurd worden, anders heeft de proef geen enkele zin.
A2 Histones are essential to have viable cells, including histone H3. You want to find out whether acetylation of H3-K56 is essential for yeast viability. What experiment can you perform to find this out? What exactly do you have to do to carry out the experiment? We will discuss every step that has to be done in the lab to perform this key experiment. (hint : arginine is the amino acid that is most similar to lysine, however it is not a substrate for lysine acetyl transferases)
2 Om te kijken of de levensvatbaarheid van gist afhangt van de onder één bewezen modificatie moet er een recombinante gist gemaakt worden die deze modificatie niet bezit. Om toch verder zo min mogelijk te veranderen aan het eiwit gaan de onderzoekers heer proberen de gemodificeerde Lysine residu te vervangen door een daarop lijkende Arginine. Een aminozuur residu wat niet gevoelig is voor Lysine acetyl transferase.

Deze modificatie wordt ook weer in verschillende stappen uitgevoerd



  • Eerst moet er een vector gemaakt worden met het aangepaste gen voor de histon. Om zo’n vector te maken wordt eerst het H3-gen ingebouwd in een E.coli plasmide. Deze plasmide bezit als selecteerbare markers een antibiotica resistentie en een zogenaamd bacterial maintenance element. Ook moet het insert de verschillende elementen bezitten om zich te kunnen handhaven in een gistcel (ARS + CEN).

  • Om het H3-gen vervolgens te recombineren tot de gewenste variant wordt een techniek toegepast die site-directed mutagenesis heet. Hierbij wordt er een PCR uitgevoerd met een primer die de gewenste mutatie bezit, maar verder geheel overeenkomt met het H3-gen. Hybridisatie en de rest van de PCR kunnen dus gewoon plaatsvinden ook al is er geen sprake van volledige complementariteit tussen de DNA-strengen.

  • Dan wordt er in een diploïde gistcel waarin één van beide H3-genen is uitgeknockt een Wildtype-plasmide (Met normaal H3-gen) gebracht en in andere diploïde cellen worden plasmiden gebracht die het gemuteerde H3-gen bezitten. Dan laten de onderzoekers deze diploïde gistcellen sporuleren en kijken naar de levensvatbaarheid van de sporen. Overleeft de helft bij de plasmide met het WT-gen en de alle vier sporen bij het plasmide met het bewerkte gen, dan betekent dat dat deze aanpassing benodigd is om te overleven voor het gist. Overleven in beide gevallen alle vier gist sporen, dan betekent dat de modificatie niet benodigd is om te overleven voor de gistcel.


B1 How would you identify the gene that codes for the H3-K56 acetylase? Outline also how you would identify the gene that codes for the enzyme that removes the acetyl group from H3-K56. (hint: search Google with the name ‘Eurosacarf’ and click on ‘deletion strain’)
1 Dit onderzoek begint met een aanpak in de bioinformatica. Er wordt gezocht in het genoom van gist op bekende acetylase volgorden (AcetylCoA). Als dit zo’n 20 hits oplevert kunnen er knock-out stammen gemaakt worden voor deze genen, vervolgens kan er dan gezocht worden naar stammen waarin er geen modificatie is op lysine 56. Het eerst probleem wat hierbij optreedt is, dat er stammen zijn die niet kunnen overleven. Er moet dan gezocht worden naar varianten op die genen die door bepaalde omstandigheden onwerkzaam kunnen worden (vb. te hoge temperatuur). Deze worden dan in tolerante omstandigheden opgekweekt en dan in non-tolerante omstandigheden gebracht. In deze stervende cel kan dan gekeken worden of er acetylase-activiteit is op de plaats 56 van de H3-staart (een aanname hierbij is wel dat er deacetylases werkzaam zijn die de acetyl-groep weg zouden halen, wanneer het specifieke acetylase-enzym niet meer werkzaam is).

>In de praktijk wierpen al deze methoden geen vruchten af, het enzym was van een onbekend type en er moest dus verder gezocht worden.


(Ik ga het verdere deel van het college zo goed mogelijk reproduceren, maar colin was erg enthousiast en soms echt onnavolgbaar)
In een groot en ingewikkeld onderzoek werd later min of meer toevallig het goede gen gevonden, wat codeerde voor een onbekende acetylase met een onbekend motief. In het experiment werd gebruik gemaakt van 4800 gemanipuleerde gist stammen. Deze zijn allemaal uitgeknockt voor één van de niet voor levensvatbaarheid vereiste genen van gist. Deze liet men sporen vormen en werden gekruist door ze bij elkaar te ‘stempelen’. Er vonden kruisingen plaats met sporen waarin 380 genen waren uitgeknockt die mogelijk iets te maken hadden met deze deactylase. Vervolgens werd naar de mate van groei gekeken die plaatsvond. Hierbij werd wildtype gist op 1.0 gesteld. Eerst werd gekeken naar de mate van groei bij de ene mutatie (vb. 0.7) en dan naar de mate van groei bij de andere mutatie (vb. 0.6) (dit alles door de grootte van kolonies in een petri-schaal na een bepaalde tijd op te meten. In het geval dat deze mutaties gecombineerd werden zou dit een groei moeten opleveren van zo’n 0.42. Is er in de praktijk een betere groei te zien, dan betekent dit dat de genen waarschijnlijk werkzaam zijn in dezelfde pathway en dat de mutaties eigenlijk hetzelfde bewerkstelligen en dus niet elkaar versterken. Is er juist een versterking van het effect, dat betekent dat de genen waarschijnlijk werkzaam zijn in twee alternatieve pathways die hetzelfde eindresultaat hebben en dat deze gehele pathway nu effectief onwerkzaam is gemaakt doordat deze beide genen gecombineerd zijn. Hierdor kan eigenlijk op zeer grote schaal gekeken worden naar de verbanden tussen genen en werd uiteindelijk na lang zoeken de onbekende acetylase gevonden, door het controleren van al dit soort ‘verdachte’ gisten.



De database wordt beschermd door het auteursrecht ©opleid.info 2017
stuur bericht

    Hoofdpagina